窦银花

(上海必诺检测技术服务有限公司，上海 201114)

草除灵是一种专效性芽后传导性除草剂，用于油菜田防除猪殃殃和繁缕，对油菜安全，对阔叶杂草有效，具有内吸传导作用[1-2]。其可以经由食物链、环境最终迁移至人和畜体内。GB 2763—2016规定：草除灵于油菜籽内的最大残留限量(MRL)为0.2 mg/kg。从2004年开始，国际标准禁止了除草灵的上市与应用[3]。

食品中农药残留分析是在复杂的基质内定性与定量分析目标化合物。对于农药残留而言，其分析步骤主要为提取、净化、检测，前2步为前处理，与分析结果的准确性和可靠性直接相关。目前中国还没有关于草除灵的检测标准，主要采用液相色谱法[3-5]和气相色谱法[6-8]进行检测，而采用液相色谱—质谱联用法(LC-MS)测定草除灵的文献较少[9-12]。研究拟采用乙腈提取，经固相萃取柱净化，LC-MS联用技术测定油菜、油菜籽内草除灵残留量，旨在为草除灵的测定提供一种有成效的科学测试方法。

1 试验部分

1.1 试验设备

电子分析天平：BL60S型，德国赛多利斯公司；

涡旋振荡器：945616型，美国Talboys公司；

捣碎机：FA25型，德国FLUKO公司；

高速冷冻离心机：Sovall ST16R型，美国赛默飞世尔公司；

氮吹仪：DC-24型，上海安谱实验室科技股份有限公司；

高效液相色谱—质谱联用仪：Agilent infinityⅡ1290/QQQ 6470B型，美国安捷伦公司。

1.2 试剂与材料

油菜、油菜籽：市售；

乙腈、正己烷、甲苯：色谱纯，美国Sigama公司；

氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

草除灵标准物质：(99.30±2.30)%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

石墨化炭黑—氨基复合柱：500 mg/500 mg，容积6 mL，北京迪科马科技有限公司；

氟罗里硅土(Florisil)固相萃取柱：500 mg/6 mL，美国Waters公司。

1.3 样品前处理

(1) 油菜：精准称量5.00 g已粉碎均匀的油菜，加入20 mL乙腈，15 000 r/min匀浆提取2 min，加入5～7 g氯化钠，多次快速振荡，8 000 r/min离心3 min，取上清移，加入10 mL乙腈，重复2次提取，准确移取上清液10 mL，于40 ℃水浴中氮气吹至近干，加入3 mL乙腈—甲苯溶液(V乙腈∶V甲苯为3∶1)，待净化。

(2) 油菜籽：精准称量5.00 g已粉碎均匀的油菜籽，加入10 mL乙腈—正己烷溶液的上层液体，涡旋振荡，静置30 min，准确加入20 mL乙腈—正己烷溶液的下层液体，15 000 r/min 匀浆提取2 min，去除正己烷层，加入5～7 g 氯化钠，剧烈振荡，8 000 r/min离心3 min，取上清移，加入10 mL正己烷饱和的乙腈溶液，重复提取2次，准确移取上清液10 mL，于40 ℃水浴中氮气吹至近干，加入3 mL乙腈—甲苯溶液(V乙腈∶V甲苯为3∶1)，待净化。

(3) 净化：用5 mL乙腈—甲苯溶液预淋洗石墨化碳黑—氨基复合柱，弃去淋洗液。将待净化液洗涤入固相萃取柱内，通过3 mL的乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯为3∶1)溶液洗涤，重复3次。于40 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL 乙腈—水溶液(V乙腈∶V水为1∶1)复溶，过0.22 μm滤膜，待测。

1.4 LC-MS分析条件

1.4.1 液相色谱 色谱柱为Poroshell 120 C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，流动相A为乙腈，流动相B为2.0 mmol/L 乙酸铵—0.1%甲酸水溶液，流速0.3 mL/min，进样体积5 μL，柱温40 ℃，按表1进行梯度洗脱。

表1 流动相洗脱条件Table 1 The mobile phase elution conditions

1.4.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源，干燥气温度350 ℃，干燥气流量5.1 L/min，雾化器压力2.4×107Pa，鞘气温度300 ℃，鞘气流速11.0 L/min，毛细管电压4 000 V，喷嘴电压1 100 V，正离子扫描模式，母离子和子离子质谱参数见表2。

表2 草除灵的母离子和子离子质谱参数†Table 2 Themass spectrometry parameters of the precursor ion and product ion of benazolin

1.5 试验方法

1.5.1 标准曲线绘制 精准称量标准品草除灵，甲醇定容，配制成质量浓度为1 mg/mL的标准贮备液。移取1 mL 标准贮备液，甲醇定容，配成质量浓度分别为100.0，10.0，1.0，0.1 μg/mL的标准中间液，用空白基质分别配制0.025，0.050，0.100，0.500，1.000，2.000 μg/mL的草除灵标准溶液，并绘制标准工作曲线。

1.5.2 提取溶剂的选择 选取乙腈(或正己烷饱和的乙腈)、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷4种不同极性的提取试剂，空白基质中加入草除灵标准溶液，测其回收率。

1.5.3 固相萃取柱(SPE小柱)的选择 选择石墨化炭黑/氨基(GCB/NH2)复合SPE小柱和弗罗里硅土柱进行对比，将草除灵标准溶液加入到空白基质中，转移全部待净化液至固相萃取柱净化，经仪器测定，计算加标回收率。

1.5.4 复溶溶剂的选择 取适量草除灵标准工作液于离心管中，氮气吹干，分别加入乙腈、水、甲醇、乙腈+水(V乙腈∶V水为1∶1)、甲醇+水(V甲醇∶V水为1∶1)5种复溶标准工作液，经0.22 μm有机滤膜过滤，待测。

1.5.5 基质效应评价 取适量草除灵标准农药贮备液，分别使用乙腈+水(V乙腈∶V水为1∶1)和空白基质样品处理液进行定容，对相同质量浓度的工作液进行测定[13]。

1.5.6 空白基质的加标回收试验 油菜和油菜籽两种空白基质中分别添加0.03，0.06，0.15 mg/kg 3个水平的标准溶液进行回收率测定，各水平重复6次。

2 结果与分析

2.1 提取试剂的选择

根据草除灵标准物质的回收率可知，乙腈(或正己烷饱和的乙腈)、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷均能高效提取草除灵，其回收率均在80%以上。其中丙酮与基质中的水互溶，难以进一步用固相萃取柱净化；乙酸乙酯和二氯甲烷在提取草除灵的同时，也提取出基质中的脂肪、蛋白、色素等杂质。对于基质油菜籽，以正己烷饱和的乙腈作为提取溶剂时，乙腈能提取出溶于正己烷中的草除灵，正己烷又能去除乙腈中的脂类杂质，有利于进一步净化。

2.2 净化小柱的选择

由图1～图3可知，对于杂质、色素，Florisil柱的吸附能力较低，对草除灵目标物的响应干扰较大，且回收率为75%左右，而GCB/NH2柱带有芳香性正六元环结构，具有高净化效果，能有效吸附色素和杂质，近乎去除基质中90%的杂质，其独特的选择性能高效地将草除灵从杂质中洗脱出来，回收率为85%左右。因此，选择GCB/NH2柱作为净化柱。

图1 草除灵标准工作液谱图Figure 1 Benazolin standard working solution spectrum

图2 经Florisil固相萃取柱净化的草除灵标准谱图Figure 2 Standard spectra of benazolin after purification by florisil solid-phase extraction column

图3 经GCB/NH2固相萃取柱净化的草除灵标准图谱Figure 3 Standard spectra of benazolin after purification by GCB/NH2 solid phase extraction column

2.3 复溶溶剂的选择

由图4可知，选择单一的甲醇和乙腈作复溶溶剂回收率为70%左右，选择水作为复溶溶剂回收率仅60%。而使用混合溶剂乙腈+水(V乙腈∶V水为1∶1)和甲醇+水(V甲醇∶V水为1∶1)的回收率相对较高。从极性角度考虑，水的极性大于甲醇，甲醇的极性大于乙腈，而草除灵是非极性物质，应选择乙腈作复溶试剂，乙腈中加入适量水可大大提高复溶试剂的极性，更利于油脂基质中草除灵的提取，所以选择乙腈+水(V乙腈∶V水为1∶1)作复溶溶剂。

图4 复溶溶剂对回收率的影响Figure 4 Effect of resolution solvent on recovery rate

2.4 基质效应

由表3可知，油菜和油菜籽基质中的草除灵离子化效率低于乙腈+水(V乙腈∶V水为1∶1)溶液中的，其基质效应为73%左右[13]，说明基质对草除灵有抑制作用。对于阳性样品而言，采用对应的空白基质配制标准曲线，草除灵离子化效率接近，可避免基质效应带来的试验结果偏离，从而提高阳性样品数据测定的准确性。

表3 草除灵的基质效应Table 3 The matrix effect of benazolin

2.5 检出限、定量限、线性关系、准确度及精密度

2.5.1 线性关系 用草除灵标准中间液配制标准曲线，其线性方程为Y=3 085.8X-16 881(R2=0.999)，相关性良好。

2.5.2 检出限与定量限 试验测得LC-MS方法的检出限为0.008 mg/kg，定量限为0.027 mg/kg。

2.5.3 准确度与精密度 由表4可知，在0.03，0.06， 0.15 mg/kg 添加水平下，油菜基质中草除灵的平均回收率为86.3%～91.3%，相对标准偏差(RSD)为4.4%～6.7%；油菜籽基质中草除灵的平均回收率为73.3%～84.2%，RSD为7.3%～8.7%。

表4 草除灵回收率和相对标准偏差Table 4 The recovery rate and relative standard deviation of benazolin

3 结论

建立了一种适合油菜和油菜籽中草除灵的检测方法。结果表明，以乙腈作为提取溶剂，石墨化炭黑—氨基复合柱净化，C18柱分离，采用高效液相色谱—串联质谱法进行测定，该方法的前处理方便快捷、净化完全、高效简便，且能够得到较低的检出限和较高的回收率，并能满足日常检测需求。有关其他类似基质中草除灵残留量的检测有待进一步探究。