孙继红, 柳 雪, 陶亚东, 刘 慧, 霍 峰， 武俊华, 徐树雷

(1.承德医学院校医院， 河北 承德 067000 2.承德医学院附属医院， 河北 承德 067000 3.河北省军区承德离职干部休养所， 河北 承德 067000)

在常见的恶性肿瘤中头颈部肿瘤排名第六位，90%为头颈部鳞状细胞癌和口腔鳞状细胞癌[1]。其中口腔舌鳞状细胞癌(oral tongue squamous cell carcinoma，OTSCC)是最常见的口腔鳞状细胞癌。根据肿瘤调查统计数据，口腔癌的5年生存率约为53%，而口腔舌鳞癌的5年生存率仅为33%～40%[2]。OTSCC通常根据临床症状，淋巴结肿大和远处转移情况评估肿瘤，并进行治疗计划分期[3]。但是这种分期系统不能为早期OTSCC提供准确的预测。因此，我们要寻找更可靠的预后标志物，以便更好地鉴别早期OTSCC具有侵袭性行为。证据显示20%～40%的患者在发病前已经有隐匿性转移[4]。干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)是一类重要的转录调节因子，该家族基因主要由IRF1-IRF9等9个成员组成。干扰素调节因子-1 (Interferon regulatory factor-1,IRF1)是IRF家族的一种肿瘤调节因子，调节干扰素的表达[5]。随着研究的深入，IRF1在炎症、免疫反应、细胞增殖、细胞周期进展、T细胞分化和DNA损伤期间的基因表达调控中的功能越来越多被报道被揭示。IRF1基因改变和/或低表达与较差的临床结果、较高的癌症易感性和较低的免疫治疗应答有关，提示IRF1在白血病、乳腺癌、宫颈癌和结直肠癌等多种癌症类型中具有抑癌作用[6]。然而，IRF1在肝癌和食管癌中的致癌能力最近有报道[7]。这些研究表明IRF1在癌症中起到抑癌基因的作用，并且与癌症类型相关。在本研究中，我们发现IRF1在口腔舌鳞癌细胞中表达显著降低。而且过表达IRF1后可以抑制口腔舌鳞癌细胞的增殖，并促进细胞凋亡。故此我们大胆推测IRF1在口腔舌鳞癌细胞中起到抑癌基因作用，并且进一步探求了IRF1的上游表达调控因子，以期能够揭示IRF1在口腔舌鳞癌细胞中的作用机制，为口腔舌鳞癌细胞的早期诊断和治疗提供分子依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器：(1)Tca-8113细胞:(天津赛尔生物技术有限公司);(2) IRF1过表达和敲降质粒:(天津赛尔生物技术有限公司);(3) 胰蛋白酶：(GIBCO BRL,美国);(4) 1640培养基:(GIBCO BRL,美国);(5)Opti-MEM:(GIBCO BRL，美国);(6)乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2):(天津市化学试剂批发公司);(7) PBS (含137 mmoL/L NaCl,2.7 mmoL/L KCl,10 mmoL/L Na2HPO4,2 mmoL/L KH2PO4);(8) 胎牛血清(FBS):(GIBCO,美国);(9)6孔,12孔,24孔培养板,T25细胞培养瓶:(Orange Scientific,比利时);(10)CO2恒温培养箱:(Thermo Forma,美国);(11)5415D型离心机:(Eppendorf,德国);(12)TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒:(Roche,瑞士) ;(13)脂质体Lipofectamine2000 Reagent:(Invitrogen,美国);(14)12对口腔舌鳞癌组织及其癌旁正常组织:(承德医学院附属医院口腔科)。

1.2细胞转染:首先进行细胞接种，100万个细胞接种至25mL细胞培养瓶中，培养过夜，次日转染。质粒的质量(μg)与脂质体的体积比例为1∶1，配制好质粒与脂质体混合物后，静置20min后再加入细胞培养瓶中。转染4h后，更换细胞培养液。

1.3TUNEL方法:细胞转染后24h，调整细胞浓度，按照4000个/孔接种14孔板。每组实验设置3个副孔。待细胞贴壁后，加0.1ppc的紫杉醇诱导凋亡1h。处理标志为：细胞部分变圆，部分形态正常。样本固定：待6孔板中细胞晾干之后，每孔加入1mL新鲜配制的固定液室温15～25℃固定细胞1h， (固定液：4%多聚甲醛溶于PH7.4 的PBS 中，新鲜配制); 漂洗；加入1mL封闭液，室温15～25℃封闭10min；(封闭液：无水甲醇稀释的3%H2O2)。漂洗；加入1mL通透液，冰上放置2min；(通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制)。制作阳性对照样本：样本在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，用DNA酶1反应液，处理30min。配制TdT酶反应液：平衡液 45μL，荧光标记液1μL，TdT 酶 4μL，共50μL 。标记：漂洗2次； 标记 60min；漂洗；染色5min。荧光显微镜下观察，可以使用的激发波长范围为450～500nm，发射波长范围为515～565nm(绿色荧光)；凋亡指数是指每张TUNEL阳性切片选取5个阳性细胞(表达绿色荧光的细胞为阳性)数最多的高倍视野(400)，计算500个舌鳞癌细胞中阳性细胞所占的百分比。

1.4实时定量PCR实验(Real-time PCR):混匀后37℃1min，50℃ 60min，70℃ 15min。cDNA产物置于冰盒中待用，或-20℃保存备用。①按照所需用量增加配比体积。配置比例如下：2 × Master Mix，5μL；10uM 的PCR特异引物F，0.5μL；10uM 的PCR特异引物R，0.5μL水，2μL。②加样 取8μL混合液分别加入至每个孔中，再按照实验分组分别加入相应的cDNA，2μL/孔；封膜，混匀，瞬离；置于冰板上备用。③设置如下反应程序：95℃，8min；95℃，10s；60℃，60s；42个循环。④计算结果:收集结果，实验中设置5个副孔，去掉最高值和最低值，取3个副孔的平均数，采用2-△△Ct法分析数据。Folds=2-△△Ct，△△Ct=(Ct1～Ct2)-(Ct3～Ct4)

1.5MTT实验:细胞转染18h后，消化，计数，以每孔6000个细胞种于96孔板，在细胞转染后不同天数的同一时间进行检测，依此加入MTT液与DMSO，然后测定A570。实验中设置5个副孔，去掉最高值和最低值，取3个副孔的平均数。

1.6荧光报告载体实验:通过Targetscan软件预测到miR-23a可以与IRF1 3’UTR相结合，结合位点序列为：AATGTGA，将该序列突变为TAAGAGT。将包含结合位点长度为150bp的野生型和突变型IRF1 3’UTR(IRF13’UTR,IRF1 3’UTR mut)构建到pCD3/EGFP载体中。以50nmoL/L ASO-NC,ASO-23a,或者200ng pcDNA3,pri-miR-23a和IRF13’UTR,IRF13’UTR mut质粒共转24孔板中的Tca8113细胞，并添加1.0μL Lipofectamine 3000转染试剂，转染4h后换液；转染48h后收集细胞进行裂解，并利用双荧光素酶试剂盒进行分析。实验中设置5个副孔，去掉最高值和最低值，取3个副孔的平均数。

1.7Western blot:裂解细胞，取上清液。配制10%凝胶，上样，分离，转膜，封闭，加入抗体，IRF1抗体和GAPDH抗体分别按照1∶200和1∶500的比例加入相应的膜中，置于4℃过夜。次日洗膜后，将二抗按照1∶1000的比例加入膜中室温作用2h。曝光，照相。用LabWorks TM凝胶成像及分析系统对胶片进行摄像，软件分析得到各组蛋白条带亮度值，并以对照组为标准值1，绘制柱状图。实验均重复3次。

2 结 果

2.1IRF1在舌鳞癌组织中表达水平降低:结果显示，与癌旁正常组织相比，IRF1在舌鳞癌组织中表达平均下降至对照组的38%，最低下降至11%，其中有一例下降至对照组98%(图1)。结果表明在12对舌鳞癌组织中，与癌旁组织相比，IRF1的表达水平明显下降，差异有统计学意义。

图1 12对舌鳞癌组织中IRF1的表达水平Real-time PCR检测舌鳞癌组织及其癌旁组织中的IRF1。

2.2IRF1 抑制舌鳞癌细胞的生长活性:由于IRF1在舌鳞癌组织中表达降低，我们构建了IRF1的过表达质粒，通过细胞转染提升Tca8113细胞内的表达水平。如图2所示，过表达IRF1后，Tca8113细胞的生长活性与对照组相比明显下降，差异有统计学意义。转染后24h检测细胞活性，过表达IRF1组下降至对照组的87%；转染后48h检测细胞活性，过表达IRF1组下降至对照组的75%；转染后72h检测细胞活性，过表达IRF1组下降至对照组的61%。上述结果表明IRF1可以抑制舌鳞癌细胞的生长活性。

图2 IRF1对Tca8113细胞生长活性的影响在Tca8113细胞中转染IRF1过表达质粒后，分别在24h，48h，72h应用MTT实验检测细胞的生长活性。

2.3IRF1促进舌鳞癌细胞的凋亡:基于以上结果，IRF1在舌鳞癌组织中表达异常降低，且IRF1可抑制舌鳞癌细胞的生长活性。我们应用紫杉醇诱导细胞凋亡(浓度为0.1ppc)，在细胞转染后24h加入紫杉醇，诱导凋亡1h，通过TUNEL实验检测IRF1对舌鳞癌细胞凋亡的影响。如图3A所示，过表达IRF1后，IRF1过表达组比IRF1-对照舌鳞癌细胞Tca8113的凋亡细胞明显增加，凋亡指数由0.9%增加到8.4%(图3B)，差异有统计学意义。结果表明IRF1可以促进舌鳞癌细胞的凋亡。

图3 IRF1对Tca8113细胞凋亡的影响(A)在Tca8113细胞中转染IRF1过表达质粒，转染后加入0.1ppc紫杉醇诱导24h后，拍照检测凋亡细胞数目。(B) 对视野内的细胞计数并统计出凋亡指数。

2.4IRF1是miRNA-23a的直接靶基因:如图4所示，生物信息学软件预测miR-23a的种子序列可以与IRF1的3’UTR相结合。IRF1野生型的3’UTR与miR-23a有7个结合位点，也称作种子序列。我们将野生型的IRF1 3’UTR构建荧光报告质粒pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTR。 我们将种子序列中突变了四个位点， 作为突变型的IRF1 3’UTR mut，构建荧光报告质粒pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTRmut。用于接下来的荧光报告载体实验。如图5所示，我们将野生型荧光报告载体pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTR，图中简写为EGFP-IRF1 3’UTR转染进舌鳞癌细胞Tca8113中，同时过表达miR-23或封闭miR-23a，结果显示过表达miR-23a后，pri-miR-23a组比pcDNA3组荧光强度降低了55%；封闭miR-23a后，ASO-23a组比ASO-NC组荧光强度增强了1.7倍，差异有统计学意义。我们将突变型的荧光报告载体pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTRmut，同时过表达或者封闭miR-23a，结果显示，pri-miR-23a组比pcDNA3组荧光强度增强1.1倍；封闭miR-23a后，ASO-23a组比ASO-NC组荧光强度降低至97%，两组差异均无统计学意义。综上，荧光实验结果显示miR-23a可以直接靶定IRF1 3’UTR野生型，并且抑制其下游的荧光基因表达，导致荧光表达降低。

图4 miR-23a与IRF1mRNA3‘UTR相结合的种子序列以及突变型

图5 荧光报告载体实验结果构建IRF13’UTR的野生型及突变型荧光报告载体，转染进舌鳞癌细胞中，同时过表达或者封闭miR-23a检测各组荧光强度

2.5舌鳞癌组织中miR-23a的表达水平:如图6所示，我们用实时定量PCR检测miR-23a的表达水平，在12对舌鳞癌组织中结果显示，在舌鳞癌组织中miR-23a表达升高，癌组织与癌旁正常组织相比miR-23a的表达水平平均升高32.5倍，最低9.2倍，最高57.4倍，差异有统计学意义。结果表明，在舌鳞癌组织中miR-23a的表达水平异常升高，起致癌基因作用，促进舌鳞癌发生发展。

图6 miR-23a在舌鳞癌组织中的表达水平应用real-time PCR检测miR-23a在舌鳞癌组织中的表达水平

2.6封闭miR-23a表达后，舌鳞癌细胞活性明显降低:上述结果显示IRF1在舌鳞癌组织中水平异常降低，上游受miR-23a调控，在舌鳞癌组织中miR-23a表达水平升高。我们大胆推测升高的miR-23a通过靶定IRF1的3‘UTR降低了IRF1的表达水平。我们合成了miR-23a的反义寡核苷酸序列ASO-23a，以此封闭舌鳞癌细胞中异常高表达的miR-23a，无意义序列ASO-NC作为对照。将ASO-23a转染进Tca8113细胞后，ASO-23a与细胞内高表达的miR-23a相结合，解除了miR-23a对IRF1的负性调控。我们应用MTT实验检测封闭miR-23a后，舌鳞癌细胞活性的改变。如图7所示，转染24h后检测舌鳞癌细胞的生长活性，与ASO-NC组相比，ASO-23a组下降了14%；转染48h后检测舌鳞癌细胞的生长活性，与ASO-NC组相比，ASO-23a组下降了24%；转染72h后检测舌鳞癌细胞的生长活性，与ASO-NC组相比，ASO-23a组下降了39%(图7)。结果表明，与ASO-NC组相比，ASO-23a组的细胞活性明显下降，且差异有统计学意义。封闭miR-23a与过表达IRF1的细胞活性检测结果一致，都降低舌鳞癌细胞的生长活性。

图7 封闭miR-23a后MTT的实验结果在Tca8113细胞中转染ASO-23a和ASO-NC，在转染后24h，48h和72h检测舌鳞癌细胞的生长活性。

2.7封闭miR-23a表达后，舌鳞癌细胞的凋亡明显增强:我们应用紫杉醇诱导细胞凋亡(浓度为0.1ppc)，在细胞转染后24h，将细胞转接种至14孔板中，加入0.1ppc紫杉醇，药物诱导细胞凋亡作用1h后，通过TUNEL实验检测IRF1对舌鳞癌细胞凋亡的影响。我们封闭细胞内源性miR-23a后应用TUNEL实验检测舌鳞癌细胞的凋亡活性。如图8所示，与ASO-NC组相比，ASO-23a组的细胞凋亡数目明显增加，且差异有统计学意义。如图8A所示，封闭miR-23a后，ASO-23a组比ASO-NC组舌鳞癌细胞Tca8113的凋亡细胞明显增加，凋亡指数由1.2%增加到7.8%(图8B)，差异有统计学意义。结果表明封闭miR-23a与过表达IRF1所得的结果一致，都可以促进舌鳞癌细胞的凋亡。

图8 封闭miR-23a后TUNEL的实验结果在Tca8113细胞中转染ASO-23a和ASO-NC，在转染后的24h应用0.1ppc紫杉醇诱导细胞凋亡1h。(A)用荧光显微镜拍照计数凋亡细胞的数目。(B) 对视野内的细胞计数并统计出凋亡指数。

3 讨 论

本研究发现IRF1在舌鳞癌的表达降低，并且IRF1可以抑制舌鳞癌细胞的细胞生长活性并且增强其细胞凋亡。我们通过TargetScan预测并经荧光报告载体实验验证IRF1上游受miR-23a调控，miR-23a通过靶定IRF1的3‘UTR降低了IRF1的表达，同时在舌鳞癌组织中miR-23a表达明显高于对应癌旁正常组织。

miRNA是非编码RNA，长度为19-25个核苷酸。它是一种新型的基因表达调控分子，可以通过调控许多基因的表达来参与各种肿瘤的发生发展[8]。此前已有研究表明，部分miRNAs与OTSCC的发生发展密切相关[9]。microRNA-21和microRNA-375可以作为口腔鳞癌的生物标志物。miR-21可降低OTSCC细胞系中HPGD的表达，荧光素酶报告基因实验证实了miR-21直接靶向HPGD mRNA。也证实了PGE2介导的miR-21的上调，提示OTSCC细胞中存在参与miR-21、HPGD和PGE2的正前馈环，有助于肿瘤的发生。miR-498和miR-940影响OTSCC细胞的侵袭和迁移能力[10]。而miR-101参与了舌鳞癌细胞的上皮间质转化和肿瘤细胞转移过程。hsa-miR-222通过直接顺式调控机制(靶向MMP1 mRNA)和间接反式调控机制(靶向SOD2间接控制MMP1基因表达)调控MMP1表达。hsa-miR-222在OTSCC侵袭中发挥重要作用，可能成为转移性疾病风险OTSCC患者新的治疗靶点。

miR-23a直接和间接调控多种基因表达和信号转导，介导肿瘤发生、肿瘤增殖、生存、细胞迁移和侵袭以及抗肿瘤治疗的反应，在癌症诊断、预后和治疗应用中发挥重要作用。例如，肺癌患者血清中循环miR-23a水平升高，miR-23a水平与促血管生成活性呈正相关。结肠癌患者血清标本外泌体中miR-301a和miR-23a表达水平升高，可以作为结直肠癌早期检测的非侵入性生物标志物[11]。在前列腺癌中，青藤碱通过抑制miR-23a的表达水平，进而前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭均受到抑制，同时细胞凋亡增加。然而，关于miR-23a在OTSCC中的表达及在OTSCC诊断中的意义的研究较少。

据报道，IRF1也可以通过结合其特定靶基因的启动子来发挥其生物学功能。例如，IRF1可以结合ras相关基因RASSF5的启动子，通过促进RASSF5表达下调RAS-RAC1通路从而抑制结直肠癌细胞的转移和增殖。在结肠癌中，IRF1表达显著降低，而且体外试验表明IRF1抑制结肠癌细胞的增殖和迁移并且可以调节细胞的周期分布。在非小细胞肺癌中IRF1发挥潜在的抑癌作用，表皮生长因子和缺氧同时抑制IRF1的表达，且与其不良预后相关。在本研究中，我们发现12份OTSCC标本中，有11份标本的IRF1水平较正常对照显著降低(P<0.001)。体外试验表明，在OTSCC细胞中过表达IRF1后，细胞生长活性显著降低，且细胞凋亡率增加。这些结果表明IRF1在OTSCC进程中起到抑制作用，这与IRF1在胰腺癌，乳腺癌，胃癌和前列腺癌中的表达模式一致[12,13]。

封闭miR-23a后，舌鳞癌细胞增殖和凋亡表型与过表达IRF1后表型改变一致。我们通过转染miR-23a的反义寡核苷酸序列，封闭了舌鳞癌细胞中异常高表达的miR-23a，通过MTT实验与TUNEL实验检测细胞的增殖与凋亡的改变，与过表达IRF1所得的表型改变一致。由于封闭了高表达的miR-23a，解除了对IRF1的抑制作用，相当于过表达了IRF1，故二者的细胞表型变化一致。

综上，本研究表明IRF1在舌鳞癌的发生发展中起到抑癌基因的作用。IRF1上游受到miR-23a的调控，在OTSCC组织中miR-23a表达明显升高，下调了IRF1的表达水平，从而促进了OTSCC细胞的增殖，抑制了细胞凋亡。