闵鹏飞 ， 宋建臣 ， 许应天 ， 王 浩 ， 杨冰祎 ， 千慧燕 ， 张 爽 ， 贾立军

(1.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心 延边大学 ， 吉林 延吉 133002 ； 2.延边大学农学院 ， 吉林 延吉 133002)

牛瑟氏泰勒虫病是由瑟氏泰勒虫(Theileriasergenti，T.sergenti)引起的一种通过蜱作为中间宿主传播的血液原虫病。其主要在牛体内的红细胞中寄生。柯赫首先在非洲达累斯萨拉姆的牛体内发现泰勒虫[1]；随后泰勒也发现了这种虫体，并将其归类为一种小梨形虫[2]；贝坦科尔特等根据形态学上的差别，建议将泰勒虫分为梨形虫属和泰勒属2个属[3]。牛瑟氏泰勒虫病首次于俄罗斯远东地区被发现[4]。自泰勒虫发现以来，世界各地便陆续报道该病。近年来，东亚、南亚、欧洲、北美洲等地均有关于泰勒虫感染的报道[5-7]。我国于1983年报道在贵州首次发现瑟氏泰勒虫[8]。瑟氏泰勒虫病的流行与蜱的活动区域、流行状况密切相关。该病呈明显的季节性与地区性流行，给养牛业带来巨大的经济损失与潜在威胁。

牛瑟氏泰勒虫病对牛的危害极其巨大，通过系统的流行病学调查，及时掌握瑟氏泰勒虫在动物中的流行现状，对瑟氏泰勒虫病的有效防控具有重要意义。本调查应用PCR方法对吉林省珲春、通化、安图、舒兰、龙井、辽源、白山共7个地区的247份牛抗凝血进行检测，旨在为防控牛瑟氏泰勒虫病提供有效的科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集 247份血液样本采自吉林省珲春、通化、安图、舒兰、龙井、辽源、白山共7个地区的养牛场，均为无菌采集抗凝血。

1.2 试剂 FastPure Blood DNA Isolation Mini Kit 试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；dNTP Mix、TaqDNA Polymerase、10×TaqBuffer、DL 2 000 DNA Marker等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物的合成 根据牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因序列，参照Cao等[9]方法设计PCR引物，引物由吉林省库美生物科技有限公司合成(表1)。

表1 PCR扩增引物Table1 PCR amplification primer

1.4 基因组DNA提取及PCR扩增 血液基因组DNA按照血液基因组提取试剂盒说明书进行提取。应用牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因引物进行PCR扩增。PCR反应体系及条件按照胡诗悦等[10]的方法进行。将PCR反应产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳完毕后将胶块置于凝胶成像仪中进行观察。

1.5 克隆载体的构建及测序 利用OMEGA凝胶回收试剂盒对目的基因片段进行胶回收，将胶回收产物连接于pMD18-T载体，连接体系：胶回收产物4 μL，Solution 15 μL，pMD18-T载体1 μL。低温恒温水浴锅设定温度16 ℃，将混合物放置水浴锅中12～14 h后得到连接产物。将连接后的产物于Trans 5α感受态细胞中进行转化，转化产物均匀涂布于AMP抗性平板，37 ℃恒温培养过夜。用挑菌环挑取生长良好的单个菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果为阳性的菌落放入AMP培养液中摇菌扩增。使用OMEGA的质粒提取试剂盒提取质粒，提取完毕的质粒分成2份，1份放入-20 ℃冰箱保存以备后续使用，1份送往长春生工生物工程有限公司进行测序。

1.6 统计分析 测序结果利用NCBI BLAST进行比对，采用MegAlign软件进行基因同源性分析。并对检测的247份样本进行不同地区、不同饲养模式、不同性别及不同年龄之间的比较，以及感染牛瑟氏泰勒虫情况进行统计学分析。

2 结果

2.1 牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因PCR检测 牛血液基因组样本经PCR扩增获得435 bp的目的条带，与预期结果相符(图1)。PCR共检测出阳性样本98份。将扩增得到的目的基因经转化克隆后送往公司测序，测序结果经NCBI BLAST同源性比对，98份测序样本均与瑟氏泰勒虫18S rRNA基因相符(GenBank登录号：MH208641.1)。

图1 部分牛血液样本PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR products from some bovine blood samplesM:DL 2 000 DNA 标准; 1～9:牛血液样本; 10:阳性对照; 11:阴性对照M:DL 2 000 DNA marker; 1-9:Bovine blood samples; 10:Positive control; 11:Negative control

2.2 扩增基因进化分析 采用MegAlign对扩增泰勒虫18S rRNA基因进行同源性分析，构建进化树(图2、3)。扩增虫株18S rRNA-Theileria-cow与BDH3扩增虫株(GenBank登录号：MF576178.1)处于同一分支，同源性为100%。与中国湖北扩增虫株、西班牙扩增虫株、印度扩增虫株的同源性为99.80%，说明扩增虫株与目前流行的虫株具有普遍同源性。

图2 不同虫株间18S rRNA基因同源性比对Fig.2 Homology of 18S rRNA gene among different insect strains▲：本次试验所得分离株▲：The isolates obtained in this test

图3 不同虫株间18S rRNA基因序列进化树Fig.3 Evolutionary tree of 18S rRNA gene sequences among different insect strains▲：本次试验所得分离株▲：The isolates obtained in this test

2.3 不同地区牛瑟氏泰勒虫感染情况 对采自吉林省7个不同地区的共247份血液样本进行PCR检测。各地牛瑟氏泰勒虫感染情况见表2。结果显示，吉林省7个地区的牛群均存在瑟氏泰勒虫感染。经统计学分析，除安图和白山地区间差异不显著(P>0.05)外，其他各地区间均差异显著(P<0.05)。

表2 不同地区牛瑟氏泰勒虫感染情况Table 2 Theileria sergenti infection in different regions

2.4 不同养殖模式下牛瑟氏泰勒虫感染情况 对PCR检测的247份牛血液样本，分析不同养殖模式对牛瑟氏泰勒虫感染率的影响。结果显示，规模化养殖和散养条件下均有瑟氏泰勒虫感染(表3)，散养模式下的牛更易感染瑟氏泰勒虫，统计学分析表明，不同养殖模式下牛瑟氏泰勒虫感染率差异极显著(P<0.01)。

表3 不同养殖模式牛瑟氏泰勒虫感染情况Table 3 Theileria sergenti infection in different feeding patterns

2.5 不同性别间牛瑟氏泰勒虫感染情况 对PCR检测的247份牛血液样本，分析牛瑟氏泰勒虫在不同性别间的流行情况，结果显示，不同性别牛均有瑟氏泰勒虫感染(表4)，但差异不显著(P>0.05)。

表4 不同性别牛瑟氏泰勒虫感染情况Table 4 Theileria sergenti infection in different sexes

2.6 不同年龄段间牛瑟氏泰勒虫感染情况 对PCR检测的247份牛血液样本，分析不同年龄段牛瑟氏泰勒虫的感染率。结果显示，不同年龄段的牛均有瑟氏泰勒虫感染(表5)，年龄越小的牛越容易感染，统计学分析表明，不同年龄段间牛瑟氏泰勒虫感染率差异显著(P<0.05)。

表5 不同年龄牛瑟氏泰勒虫感染情况Table 5 Theileria sergenti infection in different ages

3 讨论

泰勒虫病虽不是人兽共患病，但其对我国牛、羊等反刍动物养殖业造成的影响严重。调查显示，吉林延边地区牛瑟氏泰勒虫PCR阳性率为39.10%[11]；山东牛瑟氏泰勒虫血涂片阳性率为15.40%[12]；江西高安地区牛瑟氏泰勒虫PCR平均阳性率为28.30%[13]；甘肃牦牛瑟氏泰勒虫血清平均阳性率为73.99%[14]。另据相关研究报道，由于携带寄生虫的个体会在很长一段时间中处于低水平的寄生虫血症，这时很难用显微镜观察到虫体，所以利用分子生物学方法检测泰勒虫比血涂片法和血清学方法具有更高的特异性和灵敏性[15]。本调查利用PCR法对采自珲春、通化、安图、舒兰、龙井、辽源、白山共7个地区的247份牛血液进行检测，以期了解牛瑟氏泰勒虫的流行现状。PCR检测结果显示，247份血液样本检测出阳性98份，总体阳性率为39.68%。测序结果显示，所有阳性样本均为瑟氏泰勒虫感染。不同地区间牛瑟氏泰勒虫感染率差异显著(P<0.05)，其中通化地区牛瑟氏泰勒虫阳性率最高为70.00%，最低为龙井地区20.00%，出现差异的原因可能与样本采集地区的环境和采样地附近的蜱虫种类相关；不同性别间牛瑟氏泰勒虫感染率差异不显著(P>0.05)；不同养殖模式下牛瑟氏泰勒虫感染率差异极显著(P<0.01)，散养模式下的牛更易感染，可能与散养模式下管理松散，牛群更易接触蜱虫等因素有关；不同年龄段下牛瑟氏泰勒虫感染率差异显著(P<0.05)，1岁以内阳性率(56.67%)明显比3岁以上阳性率(26.80%)高，出现这种情况的原因可能与牛自身的抵抗力和养殖模式相关。

本调查与胡诗悦等[10]2013年调查的感染率(53.4%)有所降低，这与养殖场近年来对该病的重视程度和防控力度的加大有关。本调查证实吉林省境内牛瑟氏泰勒虫感染依然普遍存在，尤其是珲春、通化地区牛瑟氏泰勒虫病依然处于高发状态。蜱虫是泰勒虫的主要传播媒介，建议养殖企业要加强平时的饲养管理，尤其在蜱虫流行的地区要实施科学防蜱、灭蜱，提高环境卫生，从传染源头杜绝牛瑟氏泰勒虫病的发生[16-17]。本调查为牛瑟氏泰勒虫病的有效防控提供了科学数据，对牛瑟氏泰勒虫的研究具有积极意义。