曾启城 隋晓露 许云鹏 张艾莎 谢婷妃 袁树珍 邹杰锋 李丽香 徐子斌 陈继红

广东医科大学深圳宝安临床医学院 深圳市宝安区人民医院肾内科，广东省深圳市 518000

糖尿病肾病(DN)的发病机制包括遗传因素、糖脂代谢紊乱、血流动力学改变、炎症反应及氧化应激。足细胞结构及功能改变是糖尿病肾病蛋白尿和肾小球硬化重要病理基础，是糖尿病肾病进展核心事件。表观遗传修饰作为连接高血糖“代谢记忆”与糖尿病肾病的“纽带”而备受关注。组蛋白甲基化是表观遗传修饰的重要方式，受组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶调控。组蛋白H3K27me3是一个抑制基因转录的关键介质；组蛋白去甲基化酶通过减少其靶基因启动子区域H3K27me3水平，解除对基因的抑制进而增强基因表达[1]。有研究表明，在糖尿病啮齿动物模型的肾脏中，组蛋白H3K27me3表达下调与糖尿病肾病的病理基因相关[2]。H3K27me3具体作用机制尚不清楚，对恢复H3K27me3表达水平是否与延缓糖尿病肾病进展有关，目前相关报道较少。GSK-J4通过选择性抑制Jmjd3和UTX，减弱其特异性去掉赖氨酸三甲基化修饰[3]。本研究选用自发性2型糖尿病db/db小鼠，给予GSK-J4，抑制组蛋白去甲基化酶活性，旨在了解H3K27me3是否通过调节Nephrin和Podocin表达，减轻足细胞损伤，延缓糖尿病肾病进展。

1 材料与方法

1.1 动物 选用6周龄自发性2型糖尿病db/db小鼠40只、db/m小鼠20只，均购自美国Jackson实验室。SPF级动物房恒温环境标准化饲养2周，实验前禁食不禁水过夜，经尾静脉采血，用血糖仪测定小鼠的血糖值≥16.7 mmol/L，符合糖尿病小鼠标准后实验。将db/db小鼠40只随机分为GSK-J4干预组(G组，n=20)、糖尿病肾病组(D组，n=20)，将db/m小鼠作为对照组(N组，n=20)。

1.2 分组处理及标本收集 G组予组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4(购自MedChemExpress公司) 10mg/kg剂量尾静脉注射处理，N组、D组给予等体积PBS溶液通过尾静脉注射。频率：每3周注射1次(分别在第1周、第4周、第7周注射)，共干预10周。其余时间每天观察小鼠状态。在第10周前1d把小鼠放入代谢笼，禁食不禁水过夜。收集24h尿液保存于-80℃冰箱待测尿蛋白含量。取血并进行离心取血浆，冻存于-80℃冰箱待测血糖、血肌酐、尿素氮。分离双肾置于冰上，取8mm3大小肾组织置于10%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，其余肾组织置液氮中冷冻后以-80℃冰箱保存备用。

1.3 观察指标

1.3.1一般指标：采用全自动生化分析仪检测血糖(Glu)、24h尿蛋白(24hUTP)、血肌酐(CR)、尿素氮(BUN)。

1.3.2 肾组织H3K27me3表达：石蜡切片经脱蜡，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭后。滴加1∶50稀释的小鼠抗H3K27me3抗体(购自美国Cell Signaling Technology公司)，4℃孵育过夜;次日室温复温1h，PBS冲洗5min×3次。滴加适量辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗工作液，室温孵育2h;PBS冲洗5min×3次。二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色5min，苏木素衬染，蒸馏水浸洗玻片3遍，经梯度酒精和二甲苯脱水透明，晾干覆盖盖玻片。

1.3.3 肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达：新鲜肾组织固定、脱水、OCT包埋，8～10μm切片，烤片，置于4%多聚甲醛固定30min，于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，5min/次。经抗原修复，滴加BSA封闭液封闭30min。滴加一抗(1∶25 Nephrin antibody、Podocin antibody，均购自美国Proteintech公司)，于湿盒内4℃孵育过夜；滴加生物素化通用型二抗工作液避光室温孵育50min。DAPI染液复染细胞核，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。封片后激光共聚焦荧光显微镜下观察肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达。

1.3.4 肾脏病理学检查：取左肾组织用10%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，行HE染色，显微镜(型号：Leica EG11504)下观察。

1.3.5 肾组织足细胞凋亡程度：取肾组织石蜡包埋，切片，脱蜡，水洗，用组化笔在组织周围画圈，滴加蛋白酶K工作液修复，滴加破膜工作液覆盖组织，取TUNEL试剂盒(购自瑞士Roche公司)内试剂加到圈内覆盖组织，山羊血清室温孵育30min，切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育15min，DAB显色，苏木素复染3min，脱水封片。

1.4 统计学方法 应用SPSS Statistics 19.0统计软件处理所得数据，数值用均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般指标 db/m小鼠精神状态良好，血糖未见明显变化，db/db小鼠随着实验进行逐渐出现多饮、多食、多尿、肥胖等症状。与N组相比，D组血糖、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与D组相比，G组血糖高、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平减低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组一般指标比较

2.2 肾组织H3K27me3表达 与N组相比，D组肾组织组蛋白H3K27me3表达减少。与D组相比，G组肾组织组蛋白H3K27me3表达增多，见图1。免疫组化荧光图片平均光密度分析显示，D组Nephrin蛋白较N组表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；G组Nephrin蛋白表达量较D组表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图1 肾组织足细胞H3K27me3表达

图2 肾组织足细胞H3K27me3表达平均光密度分析 与N组比较，#P<0.05；与D组比较，*P<0.05

2.3 肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达 双重免疫荧光染色及激光共聚焦结果显示，与N组相比，D组肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达减少。与糖尿病肾病相比，G组肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达增多，见图3。

2.4 各组小鼠肾组织病理学改变 肾组织光镜表现；HE染色：与N组相比，D组有肾小球体积增大，毛细血管襻扩张，肾小球系膜细胞增生，系膜区基质增多、增宽，基底膜增厚，肾小管上皮细胞肥大、空泡变性，管腔变窄等肾脏病理改变。与D组相比，G组肾小球体积较小，毛细血管襻扩张，肾小球系膜细胞增生，系膜区基质增多、增宽，基底膜增厚，肾小管上皮细胞肥大、空泡变性，管腔变窄等肾脏病理改变较轻，见图4。

2.5 足细胞凋亡程度 与N组相比，D组足细胞凋亡程度升高。与D组相比，G组足细胞凋亡程度减轻，见图5。

3 讨论

糖尿病肾病早期就会出现足细胞功能和结构的损伤,进而引起足细胞凋亡及脱落。高糖是导致足细胞损伤的重要因素。在高糖刺激下，细胞会生成大量晚期糖基化终末产物，并在细胞内部不断聚积。 在晚期糖基化终末产物产生过程中，线粒体还会释放大量的活性氧类，过量的活性氧类打破机体氧化体系与抗氧化体系的平衡，损伤细胞。氧化应激可直接损伤细胞，诱导足细胞凋亡，最终导致肾小球的硬化和肾功能损伤，是糖尿病肾病进展的核心事件。

Nephrin是一种跨膜蛋白，只表达在肾脏足细胞上。Podocin特异性表达于足细胞的足突膜上，促进Nephri的信号转导。Nephrin和Podocin等裂孔隔膜相关蛋白分子在足突间构成拉链样结构，共同维持足细胞足突的完整性及裂孔膜的正常功能。足细胞数量、结构或功能完整性与蛋白尿的产生存在相关性[4]。

图3 肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达

图4 各组肾脏组织病理学表现

图5 肾组织足细胞凋亡

表观遗传修饰是指非基因序列改变所致基因表达水平的变化，可直接影响靶基因，改变疾病表型，作为对环境信号和病理状态的应答。表观遗传学修饰调控靶器官细胞的基因转录过程，导致炎性反应基因及多个相关信号通路活化。表观遗传修饰的失调，包括染色质组蛋白修饰和 DNA甲基化，在参与肾病发病机制的基因的表达中发挥着关键作用[5]。“代谢记忆模型实验”表明即使短期暴露于高葡萄糖也会导致NF-κBp65亚基、炎症基因和氧化应激的表达持续增加，即使恢复到正常的葡萄糖水平后仍然持续存在[6]。这可能是表观遗传学修饰模式发生了改变，表观遗传修饰调节了肾脏基因的表达。

组蛋白甲基化作为表观遗传修饰的重要途径，参与基因的表达调控、基因印记和X染色体失活，调节胚胎发育、细胞增生和分化，与细胞衰老以及肿瘤发生发展有着密切关系。组蛋白甲基化与基因激活或抑制相关，这取决于修饰的氨基酸残基和甲基化的程度。组蛋白H3K27广泛分布于小鼠肾脏组织。组蛋白H3K27me3可由Zeste基因增强子同源物2(EZH2)催化产生。EZH2参与组成多梳蛋白抑制复合物2(PRC2)聚集至启动子区域，导致靶基因转录抑制[7]。Jmjd3和UTX为含有Jumonji C结构域的双加氧酶，和EZH2作用相反，能特异性去除H3K27me3的甲基，解除转录抑制，启动靶基因表达[8]。组蛋白H3K27通过对甲基化与去甲基化调整，作为一个基因转录关键介质，引发重要生物学功能。GSK-J4是组蛋白去甲基化酶Jmjd3和UTX高效且特异性强的选择性抑制剂，通过选择性抑制Jmjd3和UTX，减弱其特异性去掉赖氨酸三甲基化修饰，上调H3K27me3的表达，对下游炎症反应、氧化、细胞凋亡和侵袭等基因表达产生抑制作用，减轻糖尿病肾病小鼠足细胞损伤。

本研究中，D组肾组织组蛋白H3K27me3表达水平减少，肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达减少，糖尿病肾病病变程度重，病理改变明显，足细胞凋亡程度增高。在G组中给予GSK-J4，增加肾组织组蛋白H3K27me3表达水平，可恢复肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达，使糖尿病肾病病变程度、病理改变减轻，足细胞凋亡程度减轻。

糖尿病肾病过程中发现组蛋白H3K27me3表达水平下降，其加重糖尿病肾病进展的可能机制：(1)糖尿病肾病病程中，血液中的高糖环境可引起Zeste基因增强子同源物2的消耗，减少了H3K27me3三甲基化，同时使启动子区域的多梳蛋白抑制复合物2水平下降，减弱了对基因转录的抑制作用。使转录因子Pax6表达上调并与TXNIP启动子结合，增加了氧化应激和蛋白尿，诱发了足细胞损伤[9]。(2)非编码RNA可以与组蛋白赖氨酸甲基转移酶和组蛋白赖氨酸脱甲基酶结合，使组蛋白去甲基化酶靶向与组蛋白H3K27me3结合，导致组蛋白H3K27me3发生去甲基化[10]。组蛋白H3K27me3水平下调，对下游NF-κB信号通路抑制作用解除。IKK复合体被激活，NF-κB被释放并进行核易位，在细胞核内与基因编码上的κB位点结合，通过转录酶启动基因表达程序。多种细胞因子、黏附分子和急性期反应蛋白的基因表达上调，导致足细胞损伤[11]。(3)糖尿病肾病病程中，基因微环境发生改变，组蛋白翻译后修饰、DNA甲基化和lncRNAs之间发生相互作用和串扰，组蛋白翻译稳定状态被破坏，可导致组蛋白H3K27me3发生去甲基化，引起miR-195的表达上调。miR-195通过级联反应下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达，并通过增加caspase-3表达，最终导致足细胞凋亡[12-13]。(4)糖尿病肾病病程中，高糖血症及基因微环境改变等多重因素作用下，使H3K27me3水平降低。可引起Notch配体Jagged-1表达水平升高。Jagge-1在细胞表面表达，然后通过与Notch1结合启动旁分泌信号，导致Notch1在细胞膜上的裂解。裂解产物NICD(ICN)进入细胞核，通过RAM域和cdc/ankyrin重复序结合CSL蛋白[CBF1、Su(H)、LAG1]并募集核转录激活蛋白家族MAML(mastermind-like)，形成三元络合转录激活物(NICD-CSL-MAML)。通过碱性螺旋—环—螺旋(bHLH)家族转录因子表达上调促进下游基因表达，从而促进细胞增殖和抑制细胞分化[14]。给予GSK-J4，提高组蛋白H3K27me3表达水平，可能减轻上述途径对肾组织足细胞损伤，而延缓糖尿病肾病的进展。

糖尿病肾病过程中，GSK-J4可通过调节组蛋白去甲基化酶活性，增加H3K27me3表达，维护足细胞功能和结构的完整，延缓糖尿病肾病进展。