吴浩铭，朱怡轩，曾韦植，刘 梅，李梦飞，劳运涛，张中超，郭 新，李明丽

（云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201）

宣和猪是针对优质猪肉市场和宣威火腿产业的发展需求，以云南地方猪种乌金猪为母本培育的新品种，2018年获得国家畜禽新品种证书。相较于乌金猪，经10余年选育而成的新品种宣和猪在生长、胴体、繁殖等主要生产性能方面都有了明显的提高，保持了乌金猪原有的肉质优良、耐粗饲、母性好以及适应性强等优势［1］，从而表现出了极为明显的优质高效的特征，已经成为优质猪肉以及生产宣威火腿的理想猪种。不断提升宣和猪肉质以及生长性能一直是育种工作者们所追求的共同目标。

成 纤 维 细 胞 生 长 因 子14（fibroblast growth factor14，FGF14）基因是成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）基 因 家 族 的 一 员。Godponsrowicz等［2］于1974年在牛脑组织和垂体组织中发现了成纤维细胞生长因子（FGF），其广泛分布于无脊椎动物和脊椎动物体内，生物学活性比较丰富。研究表明，FGF在机体的自身发育和多种生理过程中起着至关重要的作用［3］：（1）影响细胞的增殖、分化及迁移，参与机体组织修复及再生。Goetz等［4］研究发现，FGF是一种分泌蛋白配体，以自分泌、内分泌或者旁分泌的方式来维持机体在组织内的稳态以及新陈代谢中的效能。FGF不仅和细胞的增殖、分化和迁移有关，还作用于组织修复和再生，它能使未分化间充质干细胞的增殖加快，提高其血管活性［5］。（2）影响胚胎发育和器官的形成过程。FGF是一种严格高度保守的信号分子，在胚胎发育和大多数组织器官的形成中发挥了极其重要的作用。有研究表明，FGF在神经诱导、神经轴突导向和突触的形成中发挥关键作用，从原肠胚形成开始到胚后发育过程中都能见到FGFs信号的表达［6］。（3）参与神经元的形成。Coebergh等［7］与Brusse等［8］的研究发现，FGF14基因突变引起了一种新的脊髓小脑共济失调（SCA 27），使小脑和基底神经节发生神经退行性变化。因此，FGF在神经系统的发育过程、胚胎发育过程以及细胞分化过程中产生了重要影响。此外，FGF在肝脏、神经、脂肪组织中也有良好的修复和再生潜能［9-10］。FGFs的基因结构和氨基酸序列在进化过程中高度保守，多数成纤维细胞因子通过结合或激活细胞表面的酪氨酸激酶受体/成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factors receptors，FGFRs）来发挥其生物学活性［11］。

猪的FGF14基因主要包含了5个外显子和4个内含子，位于猪的11号染色体上。由Ensembl数据库可知，此基因全长为169768 bp，编码区长度为1701 bp。现有研究已证实，FGF14基因对机体物质和能量代谢、细胞分裂分化、生存和凋亡等发育和生理过程均具有重要的调节作用。但有关猪FGF14基因与其与经济性状的相关研究还未见报道。本研究将FGF14基因作为宣和猪生长性状相关的候选基因，通过分析各SNP变异位点与7个生长性状间的关联程度，进一步深入探索FGF14基因对宣和猪生长性状的影响，为利用FGF14基因标记改良猪的生长性能提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本次研究所用的366头（♂163头，♀203头）宣和猪的耳组织样采自云南省宣威市良种猪场，该猪群饲养管理条件一致，系谱清楚、身体健康、发育正常。所采耳组织均浸泡于装有75%酒精的EP管中，放于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 生长性能测定

本研究共测定了7个生长性能，包括70日龄体重、4月龄体重、6月龄体重、0日龄~4月龄日增重、4月龄~6月龄日增重和70日龄~6月龄日增重。各性状的测定参照《全国生猪遗传改良计划工作手册》［12］进行，美国Renco背膘仪用来测定宣和猪的活体背膘厚。以上性能测定均在宣威市良种猪场内进行。

1.3 基因多态性检测

1.3.1 基因组DNA的提取与检测 使用北京擎科（昆明）生物科技有限公司的试剂盒来提取DNA，提取方式皆按说明书进行。通过点样于1%的琼脂糖凝胶和超微量检测仪（Nano Drop 2000）中对待检测的DNA样品进行定性和定量分析。把质检合格后的DNA放入-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 引物设计与合成 根据GenBank数据库提供的猪FGF14基因（NC_010453.5）的序列，使用Primer Premeier 5.0软件设计1对引物，序列为F：5’-TTGTATGGTCTATTCGTGCCT-3’；R：5’-CAGCTTTCCAGGAGGGTT-3’，送至北京擎科（昆明）生物技术有限公司合成，预期产物大小为477 bp。

1.3.3 PCR反应体系及程序 PCR扩增反应体系总体积：25 μL，其中，含有Mg2+的10×Buffer（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，前、后引（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1.0 μL以及ddH2O 18 μL。

扩增过程包括：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，设定35个循环；72 ℃延伸7 min后于4 ℃保存。

1.3.4 目标片段测序与基因型判定 扩增产物由北京擎科（昆明）生物技术有限公司来负责DNA序列正向测序。然后通过BioEdit、SeqMan等软件对DNA序列进行比对分析，筛查SNP位点并通过其碱基序列判定个体基因型。

1.4 统计分析

1.4.1 基因型频率和基因频率计算 根据FGF14基因分型结果，统计试验猪群中各SNP位点不同基因型的个数，并据此计算出各位点的基因型频率、基因频率、杂合度（heterozigosity， H）和多态信息含量（polymorphic information content，PIC），通过x2检验进行Hardy-Weinberg平衡检验。

1.4.2 单倍型分析 利用Phase 2.0软件对FGF14基因外显子4的2个SNPs进行单倍型分析，获得FGF14基因的单倍型及单倍型组合类型，并计算其单倍型频率。

1.4.3 不同基因型的性状差异分析 宣和猪FGF14基因外显子4上的2个SNPs位点的不同基因型和单倍型组合的生长性状差异通过下列最小二乘模型进行分析：

式中，Yij表示性状观察值；μ表示群体均值；Gi表示FGF14基因各SNP位点的第i基因型（或单倍型组合）效应；Sj表示第j性别效应；eij表示随机误差，假定服从N（0，2e）分布。

采用SAS 9.2统计分析系统的GLM过程［13］计算出各SNP位点不同基因型或不同单倍型组合性状的最小二乘均数和标准误，结果以“最小二乘均数±标准误”形式表示，且进行差异显著性检验，以P <0.05作为差异显著性的判断标准。

2 结果与分析

2.1 FGF14基因的PCR扩增与基因分型

所提取的基因组DNA，条带清晰明亮无明显的弥散（图1）。大小（477 bp）与所预期结果相符，满足进一步测序的最基本要求。

图1 PCR扩增结果

PCR产物测序结果显示：FGF14基因外显子4区域检出了2个SNPs位点，即CDS 493 bp处的T→A，593 bp处的A→G，均为同义突变。2个位点均检测出3种基因型，即T493A的TT、TA和AA基因型（图2）；A589G位点的AA、AG和GG基因型（图3）。

图2 T493A位点的测序结果

2.2 T493A和A589G位点的多态性分析

宣和猪FGF14基因外显子4上的2个突变位点的基因频率及基因型频率表现出高度连锁的规律（表1）。如表1所示，从基因型频率上来看，T493A和A589G位点分别以TT（0.6230）基因型和AA（0.5546）基因型的频率最高，而AA（0.0464）基因型和GG（0.0546）基因型的频率最低；从基因频率上来看，T493A位点上的T等位基因频率（0.7883）高于A等位基因（0.2117）；A589G位点上的A等位基因频率（0.7500）高于G等位基因（0.2500）；从PIC和H值来看，宣和猪FGF14基因外显子4的T493A和A589G位点均属于中度多态，且都处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。

2.3 T493A和A589G多态位点的单倍型分析

宣和猪FGF14基因的T493A和A589G位点的单倍型及其组合频率见表2。如表所示，共存在4种单倍型频率由高到低分别为：TA>TG>AA>AG；单倍型组合：9种，以TA/TA组合的频率最高（0.3525），TA/TG次之（0.2404），TG/AG型组合的频率最低（0.0109）。

表1 T493A和A589G位点的基因型及基因频率

表2 T493A和A589G位点的单倍型分析及组合频率

2.4 各SNP位点不同基因型的生长性状差异

在所分析的7个生长性状中，除70日龄体重外，T493A和A589G位点不同基因型在宣和猪其余6个性状上均存在显著或极显著差异（P<0.01或P<0.05）。T493A位点的AA型个体在6月龄体重、70日龄~4月龄日增重、4~6月龄日增重以及70日龄~6月龄日增重上均极显著高于TT型个体（P<0.01），但是与杂合子之间的差异不显著（P >0.05），6月龄背膘厚也以AA基因型个体最大，且显著高于TT基因型个体（P<0.05），而与TA基因型个体间的差异未达到显著水平（P>0.05）；而A589G位点GG型个体的4月龄体重、6月龄体重、6月龄背膘厚和70日龄~6月龄日增重均为最高（P<0.01或P<0.05）。两个位点的不同基因型在其他生长性状上均无显著差异（P>0.05）。

表3 T493A和A589G位点各基因型的生长性状

2.5 不同单倍型组合的生长性状差异

宣和猪FGF14基因T493A和A589G位点不同单倍型组合的生长性状差异见表4，结果表明，除了70日龄体重外，9种单倍型组合在其他6种生长性状上都表现出显著差异（P<0.01或P<0.05），与单个SNP位点分析结果保持一致，且2个位点的基因型间表现出明显的协同作用。此外，在9种单倍型组合中，携带有AG单倍型的宣和猪个体在6月龄体重、70日龄~4月龄日增重、4~6月龄日增重及70日龄~6月龄日增重上总体高于其他单倍型组合的个体，T493A位点的A等位基因和A589G位点的G等位基因呈现出协同增效作用。

3 讨论

成纤维细胞生长因子（FGF）是一种能促进成纤维细胞增殖的活性物质，促进3T3细胞分裂增殖，在多种生理和发育过程中发挥着至关重要的作用，参与细胞增殖与分化、组织修复与再生、胚胎发育等过程［3］。研究证实，FGF14基因在发育及成熟的神经系统中表达，特别在退行性神经系统中脊髓小脑共济失调27型（SCA27）和阿尔兹海默症中发挥重要作用［9，14］。但有关成纤维细胞生长因子14（FGF14）基因在猪上的研究还很少，Tan等［15］对杜洛克猪群进行了全基因组关联分析，其结果表明，FGF14基因对猪乳头数量有极显著影响。Yan等［16］对白杜洛克×二花脸F2群体的血液学性状进行了全基因组序列关联研究，发现FGF14基因对240日龄平均红细胞的血红蛋白含量有显著影响。这些研究结果表明猪的FGF14基因具有明显多效性。

表4 不同单倍型组合的生长性状

本研究在宣和猪FGF14基因外显子4区域内发现了T493A和A589G两个位点，均为中度多态（0.250.05），说明在群体遗传突变、选择、迁移和遗传漂变因素的作用下，该基因处于遗传动态平衡［17］。而王思寒等［18］在延边黄牛FGF14基因的第3外显子上发现了1个多态位点，631947 bp处的A→G，卡方独立性检验结果显示，该突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态。可见，PID1基因在不同物种内的遗传差异很大。

不同位点各基因型的关联分析结果表明：T493A位点的AA基因型和A589G位点的GG基因型对协同提高宣和猪生长性能可以产生一定的效应，对6月龄体重、70日龄~4月龄日增重、4月龄~6月龄日增重、70日龄~6月龄日增重和6月龄背膘厚这几个生长性状均表现出显著差异（P<0.01或P<0.05）；此外，T493A、A589G位点不同单倍型组合在生长性状上的影响也呈现出明显的生长阶段特异性。在4月龄体重上，以TG/AG组合最高；6月龄体重、70日龄至4月龄日增重、4~6月龄日增重和70日龄~6月龄日增重，以AG/AG组合为最高；而6月龄背膘厚，以TG/TG组合为最高。可见，T493A、A589G两个位点对目标性状的影响具有明显的协同效应。此外，本研究结果进一步证实宣和猪FGF14基因与6月龄体重、70日龄~4月龄日增重和6月龄背膘厚存在显著关联。王思寒等［18］的研究发现，FGF14基因不同基因型对16月龄延边黄牛背高和尻长均具有显著影响（P<0.05），对24月龄延边黄牛的体高、体重、十字部高均具有显著影响（P<0.05）。因此，可以推测FGF14基因对动物的生长性状有一定的影响，在不同物种中的影响差异较大。

研究结果初步表明，FGF14基因与宣和猪的生长性状间存在显著关联，是一个有关于猪生长性状的重要生长标记，具有重要的研究意义。而目前有关猪FGF14基因多态性及其对生长性状影响的相关研究还未见报道，若想进一步深入揭示该基因对相关性状的真实效应，还需在不同猪种中对其确切效应加以研究，这对猪育种的实践应用具有重要意义。

4 结论

本研究在宣和猪FGF14基因外显子4上检测出了T493A和A589G两个位点。T493A位点以TT基因型和T等位基因的频率最高，A589G位点以AA基因型和A等位基因的频率最高；T493A位点的AA基因型、A589G位点的GG基因型以及AG/AG单倍型组合对宣和猪6月龄体重、70日龄~4月龄日增重、4月龄~6月龄日增重和70日龄~6月龄日增重产生了明显的协同促生长效应。