姜莉莉，武海斌，宫庆涛，张甘雨，王雅红，孙瑞红*

（1.山东省果树研究所/山东省现代设施果树技术创新中心，山东 泰安 271000；2.泰安市板栗协会，山东 泰安 271035）

板栗（Castanea mollissima B L）属壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea），其果实具有较高的营养和保健价值，深受消费者的喜爱，素有“木本粮食”之称［1］。中国是世界板栗第一生产大国，种植面积和产量均位居世界首位［2］。

由于板栗大多种植在山区或坡地上，缺水少路，管理不便，板栗病害发生严重，一直是困扰栗农的重要难题，也是影响板栗质量收益的主要因素［3］。同时，部分板栗种植区与水源保护区毗邻，病虫害化学防控受到限制，安全、精准防控技术亟待完善［4］。

栗疫病是由子囊菌亚门核菌纲球壳目间座壳科隐丛壳属栗疫病菌Cryphonectria parasitica （Murr.） Barr.寄生引起的真菌病害，嫁接不久、生长环境贫瘠的栗树易感此病，易成片发生，甚至导致树死园毁［5］。任菲等［6］报道，盾壳霉属病原菌Coniothyrium phrinum可引发板栗叶斑病，链格孢属病原菌Alternaria alternata可引起板栗叶焦枯病。姜淑霞等［7］报道，拟茎点霉属病原菌Phomopsis mollissmae可侵染板栗引起褐缘叶枯病，并易诱发板栗疫病。板栗内腐病又称栗种仁斑点病，可在栗果外观正常的情况下，在种仁上产生坏死性病斑，使果仁失去食用价值［8］。张馨方等［9］报道，内腐病病原菌从6月中旬授粉期开始侵入板栗花柱和栗苞，8月中旬以后侵入的病菌数量逐渐增多，但在近成熟期病菌才侵入种仁。内腐病由多种病原菌复合侵染所致，包括胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、聚生小穴壳菌（Dothiorella grgaria）等。

山东省是我国板栗主产区之一，栽培历史悠久，品种资源丰富［10］。泰山周边地区分布着丰富的古板栗资源，可为板栗良种选育提供丰富且优质的种质来源［11］。本研究采用高通量测序技术，分析比较了泰安市岱岳区祝阳镇麻塔村古栗与同村种植的“红栗2号”［12］5年生树不同物候期及部位的微生物群落结构差异，比较了采收期果实营养成分差异，并进行了相关性分析，以期为探索板栗病害的成灾机理和科学防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验取样区域

试验区选址于山东省泰安市岱岳区祝阳镇麻塔村（117°21′15″E，36°11′50″N），为山地板栗园。分别随机选取3株树龄30年以上的古栗树和树龄5年的“红栗2号”进行取样，每株为一个重复。供采样板栗树于2020年5月中旬喷施50%多菌灵可湿性粉剂（山东华阳农药化工集团有限公司）1000倍液和1%阿维·吡虫啉乳油（顺毅股份有限公司）1000倍液，采用常规栽培管理。

1.2 样品采集

分别于2020年8月26日（膨果期，p）和9月12日（成熟期，c）采集果实和叶片。以蘸有0.2 mol/L磷酸缓冲液的无菌拭子擦取板栗叶片（y）和果实（g）表面的微生物，将拭子置于无菌离心管中，干冰保存送样。真菌和细菌群落结构的高通量分析由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

于2020年10月3日采集2种板栗的成熟果仁，用于养分含量测定。

1.3 测序分析

提取样本基因组DNA，以琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，以无菌水将其浓度调整至1 ng/μL。以此基因组DNA为模板，使用带Barcode的16 S V4区引物（515F/806R）和ITS1区引物（ITS1-1F-F/ITS1-1F-R）进行PCR扩增。PCR产物根据浓度进行等量混样，以琼脂糖凝胶电泳纯化后进行胶回收。构建文库，经Qubit定量和检测合格后，进行Ion S5TMXL（Thermofisher）上机测序。

对数据进行低质量剪切，截去Barcode和引物序列，去除嵌合体序列，得到有效数据。以Uparse 7.0.1001软件对各样品的有效数据进行聚类，将一致性高于97%的序列聚类为OTUs，选取频数最高的序列作为代表性序列。用Mothur方法与SSUrRNA数据库对OTUs序列进行物种注释分析，获得分类学信息，并分别在界kingdom、门phylum、纲class、目order、科family、属genus、种species共7个分类水平统计各样本的群落组成。以数据量最少的样本为标准进行均一化处理，并以此进行后续的α-和β-多样性分析。

使用Qiime软件计算Chao1、Shannon、Simpson、 ACE、Goods-coverage和PD_whole_tree 指数，使用R软件（版本号2.15.3）绘制稀释曲线。采用R软件的corr.test函数计算物种和环境因子的Spearman相关系数值并检验其显著性，使用pheatmap函数进行可视化。

1.4 果实养分含量的测定

可溶性淀粉含量测定采用碘显色法［13］，可溶性总糖含量测定采用蒽酮比色法［14］，脂肪含量测定采用索氏抽提法［15］。

2 结果与分析

2.1 样本测序深度与数据质控

由图1可知，随着测序深度的增加，各样本的稀释曲线均逐渐趋缓，表明测序深度已达到要求，能够反映各样本的细菌和真菌群落结构组成。

2.2 红栗和古栗不同物候期和部位的细菌和真菌α-多样性指数的比较

由表1可知，对细菌而言，古栗膨果期和成熟期叶片和果实的α-多样性指数均高于红栗，表明古栗树体的细菌多样性、丰度和优势度高于红栗；其中成熟期古栗果实（gl.g.c）最高，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指 数 分 别 为5.242、0.858、1010.069和1019.654，膨果期红栗果实（hl.g.p）最低，分别为1.700、0.449、217.546和221.063。对真菌而言，红栗和古栗各生育期和部位的α-多样性指数差异不大，其中膨果期古栗叶片（gl.y.p）最高，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指 数 分 别 为5.382、0.950、721.374和712.740。

图1 红栗和古栗不同物候期各部位样本的16 S和ITS稀释曲线

表1 红栗和古栗不同物候期和部位的细菌和真菌α-多样性指数的比较

2.3 红栗和古栗不同物候期和部位真菌相对丰度的比较

由图2可知，红栗和古栗膨果期果实（hl.g.p和gl.g.p）的尾孢属Cercospora相对丰度均较高，红栗成熟期叶片和果实（hl.y.c和hl.g.c）的链格孢菌Alternaria相对丰度均较高，古栗成熟期果实（gl.g.c）的垫壳孢属Coniella相对丰度最高，红栗膨果期叶片和古栗成熟期叶片（hl.y.p和gl.y.c）的茎点霉属Phoma相对丰度较高，古栗膨果期叶片和果实（gl.y.p和gl.g.p）的枝孢属Cladosporium相对丰度较高，红栗成熟期叶片（hl.y.c）的柱隔孢属Ramularia相对丰度较高，古栗成熟期叶片（gl.y.c）的短梗霉属Aureobasidium相对丰度最高。

2.4 红栗和古栗不同物候期和部位细菌相对丰度的比较

由图3可知，古栗膨果期叶片（gl.y.p）的青枯菌属Ralstonia相对丰度较高，果实（gl.g.p）的甲基杆菌属Methylobacterium相对丰度较高。红栗成熟期果实（hl.g.c）的滑柱菌属Herpetosiphon相对丰度较高。古栗成熟期叶片（gl.y.c）的假单胞菌Pseudomonas相对丰度较高，果实（gl.g.c）链球菌属Streptococcus和根瘤菌属Allorhizobium相对丰度较高。

2.5 红栗和古栗果实养分含量的比较

由表2可以看出，红栗果实的可溶性总糖、可溶性淀粉和粗脂肪含量分别为29.70 mg/g、392.41 mg/g和0.48%，均显著高于古栗的6.63 mg/g、322.42 mg/g和0.29%。可见红栗的营养成分含量远高于古栗。

表2 红栗和古栗养分含量的比较

图2 红栗和古栗不同物候期和部位的真菌相对丰度

图3 红栗和古栗不同物候期和部位的细菌相对丰度

2.6 板栗微生物相对丰度与养分含量的相关性分析

2.6.1 板栗细菌相对丰度与养分含量的相关性分析 由图4可以看出，板栗果实理研菌科Rikenellaceae相对丰度与淀粉含量呈显著负相关，与脂肪含量呈极显著负相关。短波单孢菌属Brevundimonas相对丰度与脂肪含量呈显著正相关。埃希氏杆菌属Escherichia相对丰度与脂肪含量呈显著负相关。鞘氨醇单孢菌Sphingomonas相对丰度与淀粉和脂肪含量呈显著正相关。链球菌Streptococcus相对丰度与淀粉和脂肪含量呈显著负相关。根瘤菌Allorhizobium相对丰度与脂肪含量呈显著正相关。

2.6.2 板栗真菌相对丰度与养分含量的相关性分析 由图5可知，板栗果实座囊菌纲Dothideomycetes相对丰度与糖、淀粉和脂肪含量均呈显著负相关。

3 讨论与结论

传统的病原菌分离鉴定方法仅能研究可培养微生物，而对不可培养的微生物种类及丰度无法进行系统分析。高通量测序技术通过PCR扩增，对目标区域的DNA富集后进行序列测定，能够较为全面和准确地反映微生物群落结构，已成为近年来分析微生物多样性的常用且有效手段［16］。路颖等［17］采用高通量测序技术，分析了泰山4种优势造林树种刺槐、麻栎、油松和赤松叶片凋落物分解对凋落物内细菌群落结构的影响，发现细菌群落多样性受凋落物化学性质影响，尤其是初始碳氮比和木质素氮比。李志杰等［18］以多环芳烃污染盐碱土壤为研究对象，采用高通量测序技术，分析了翅碱蓬根际与非根际土壤的细菌群落结构，发现翅碱蓬能够有效降低根际土壤盐含量并改善碳氮比，提高嗜盐碱多环芳烃降解微生物的关键基因丰度。

本研究采用高通量测序技术，分析了板栗不同物候期和部位的真菌和细菌群落结构。真菌相对丰度比较发现，红栗和古栗膨果期果实（hl.g.p和gl.g.p）的尾孢属Cercospora相对丰度均较高，该属真菌可引起玉米灰斑病［19］、甘蔗褐斑病［20］等病害，但对板栗果实的危害尚未见报道。红栗成熟期叶片和果实（hl.y.c和hl.g.c）的链格孢菌Alternaria相对丰度均较高，表明受板栗叶焦枯病侵染的风险较大［6］。古栗成熟期果实（gl.g.c）的垫壳孢属Coniella相对丰度最高，该属真菌可引起石榴干腐病［21］、葡萄白腐病等病害，也包括栗生垫壳孢菌［22］。红栗膨果期叶片和古栗成熟期叶片（hl.y.p和gl.y.c）的茎点霉属Phoma相对丰度较高，该属真菌可引起板栗褐缘叶枯病，并易诱发板栗疫病和内腐病。古栗膨果期叶片和果实（gl.y.p和gl.g.p）的枝孢属Cladosporium相对丰度较高，该属病原菌可引起番茄叶霉病［23］和多种作物果实腐烂［24］。红栗成熟期叶片（hl.y.c）的柱隔孢属Ramularia相对丰度较高，该属真菌可引起山莴苣白腐病等病害［25］。古栗成熟期叶片（gl.y.c）的短梗霉Aureobasidium相对丰度最高，该属真菌作为益生菌被广泛报道［26-27］。细菌相对丰度比较发现，古栗膨果期叶片（gl.y.p）的青枯菌属Ralstonia相对丰度较高，该属病原菌可引起烟草青枯病等病害［28］。古栗膨果期果实（gl.g.p）的甲基杆菌属Methylobacterium相对丰度较高。红栗成熟期果实（hl.g.c）的滑柱菌属Herpetosiphon相对丰度较高。古栗成熟期叶片（gl.y.c）的假单胞菌Pseudomonas相对丰度较高，果实（gl.g.c）链球菌属Streptococcus和根瘤菌属Allorhizobium相对丰度较高，均可作为益生菌使用［29-30］。综合比较可以发现，红栗受链格孢菌等真菌侵染风险较高，古栗树体益生菌相对丰度较高。

图4 板栗细菌相对丰度与养分含量的相关性分析

图5 板栗真菌相对丰度与养分含量的相关性分析

不同产地和品种的板栗中各营养成分含量均有较大差异。本研究通过养分含量测定发现，红栗果实的可溶性总糖、可溶性淀粉和脂肪含量均显著高于古栗。可见经过科研人员的多年品种选育，板栗的营养成分性状已得到系统优化和改良。相关性分析发现，短波单胞菌属相对丰度与脂肪含量呈显著正相关，埃希氏杆菌属相对丰度与脂肪含量呈显著负相关，鞘氨醇单孢菌相对丰度与淀粉和脂肪含量呈显著正相关，链球菌相对丰度与淀粉和脂肪含量呈显著负相关，根瘤菌相对丰度与脂肪含量呈显著正相关。