张 月， 郭月英， 要 铎， 黄 欢， 张 敏， 苏 琳，赵丽华， 杜 霞， 靳 烨,*

(1.内蒙古农业大学 食品科学与工程学院， 内蒙古 呼和浩特 010018;2.内蒙古乌拉特中旗农牧和科技局， 内蒙古 巴彦淖尔 015300)

苏尼特羊属于内蒙古的优良肉羊品种，其体型较大，产肉率高。苏尼特羊肉具有丰富的蛋白质和人体必需的脂肪酸，肌内脂肪分布均匀，深受广大消费者的喜爱。但随着消费者生活水平和保健意识的提高，人们除追求羊肉来源的安全性外，羊肉的品质也受到了越来越多的关注。羊肉的品质主要包括色泽、嫩度、肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)含量、脂肪酸组成等。色泽是反映肉品质最直观的指标之一，消费者通过肉的色泽(肉的外观和颜色)评价肉的新鲜程度；嫩度则能够体现肉的质地；IMF不仅直接影响肉的适口性，而且能够直接影响肉的嫩度和多汁性[1]。因此通过调节羊脂质代谢，进而提升羊肉品质是推动肉羊产业持续发展的保障。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是目前较为安全的饲料添加剂，在调节反刍动物肠道平衡、提高动物机体免疫力及改善肉品质等方面具有较高的应用价值[2]。LAB进入动物机体后产生的大量代谢物，如乳酸、乙酸、丁酸等能够参与脂肪酸合成，调节体内脂质代谢通路[3]。Rabelo等[4]将布氏乳杆菌添加到青贮饲粮中发现肉牛的生长性能和 IMF含量均提高。Chen等[5]发现日粮添加鼠李糖乳杆菌对肉鸡大腿的脂肪含量、pH值以及色泽有显著影响。Dovile等[6]研究认为日粮添加植物乳杆菌能够增加Suffolk羊肉的水分含量。Lin等[7]研究发现饲粮中添加适当的益生菌能够改善猪肉中脂肪酸的组成，提高总不饱和脂肪酸的含量，进而增加猪肉的营养价值。尽管已有研究认为日粮添加乳酸菌可能对肉品质产生一些影响，但这些研究的对象大部分是禽类动物，关于乳酸菌对反刍动物，特别是对羊脂质代谢及肉品质的影响较少，因此本研究通过测定苏尼特羊肉品质及营养成分，血液中脂质代谢相关指标，肌肉中脂肪酸组成及脂质代谢相关基因表达量，探究日粮添加乳酸菌对苏尼特羊脂质代谢及肉品质的影响，以期为乳酸菌作为饲料添加剂在生产中的合理利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纯种苏尼特羊，内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗，12只3月龄，健康无病，平均体重为(18.70±2.69) kg。动物实验严格遵守内蒙古农业大学动物护理指南相关规定执行。

日粮添加使用的乳酸菌为乳安邦复合制剂(活菌数为1.5×109CFU/g)，主要成分为干酪乳杆菌LactobacilluscaseiHM- 09、植物乳杆菌LactobacillusplantarumHM- 10；甲醇(色谱纯)、正己烷(色谱纯)、氢氧化钠(分析纯)、乙醚(分析纯)、三氯甲烷(分析纯)、三氟化硼- 乙醚络合物，国药集团化学试剂有限公司；37 种脂肪酸甲酯的混合标准品，美国Sigma公司；RNA ISO Plus、SYBR®Premix Ex TaqTMII，大连宝生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

pH- STAR型胴体pH值直测仪，德国Matthaus公司；C- LM3B型数显式肌肉嫩度仪，东北农业大学工程学院；TC- P2A型全自动测色色差计，北京奥仪克光电仪器有限公司；Scion GC型气相色谱仪，天美(中国)科学仪器有限公司；UV- 1800型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；LightCycler®96型实时荧光定量PCR仪，罗氏诊断产品(上海)有限公司；Biometra型PCR扩增仪，美国Applied Biosystems公司；BG- power5000型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽，北京百晶生物技术有限公司；凝胶成像系统，美国Bio- Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1饲养实验设计

选取3月龄健康无病的纯种苏尼特羊12只，随机分为对照(C)组、乳酸菌(L)组，每组各6只，公母各半。C组饲喂基础日粮，基础日粮组成及主要营养成分见表1、表2；L组的日粮是在C组日粮的基础上额外添加乳酸菌(添加量为精料质量的1%)，搅拌均匀。2组实验羊分别在大小相同的羊舍中集体饲喂，羊舍为半开放式，温度、光照、通风等条件均一致，经过为期7 d的预饲期，确定乳酸菌对苏尼特羊无不良影响后进行为期90 d的正式实验，实验期间可自由饮水、采食。

表1 基础日粮组成Tab.1 Composition of basic diet %

表2 基础日粮营养成分Tab.2 Nutrient composition of basic diet %

1.3.2肉品质及营养成分的测定

屠宰后利用pH- STAR型胴体pH值直测仪测定0 h和24 h的pH值(pH0 h、pH24 h)；使用TC- P2A型全自动测色色差计测定肉的色泽(亮度L*值、红度a*值、黄度b*值)；采用C- LM3B型数显式肌肉嫩度仪，垂直于肌肉纤维方向进行肌肉嫩度的测定；将大小约为2.5 cm×3 cm×5 cm的肌肉块密封，水浴(75 ℃)煮制45 min后取出，冷却，称量煮制前后肌肉块的质量差，差值除以煮制前的质量，为蒸煮损失。

根据GB 5009.5—2016、GB 5009.3—2016、GB 5009.6—2016、GB 5009.4—2016分别测定肌肉中粗蛋白质、水分、粗脂肪、灰分含量。

1.3.3血脂成分的测定

使用南京建成试剂盒分别测定血清中高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL- C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL- C)、甘油三酯(triglycerides，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)的含量。

1.3.4脂肪酸组成的测定

参考Folch[8]与GB 5009.168—2016等方法进行适当调整后提取脂肪酸甲酯，采用气相色谱分析。GC条件：Rt- 2560石英毛细管柱色谱柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；温度由60 ℃升至120 ℃，速度为30 ℃/min，稳定5 min后继续升高至250 ℃，速度为5 ℃/min，稳定25 min，结束升温。离子源温度和传输线温度分别为250 ℃和280 ℃。样品中脂肪酸根据37种脂肪酸混合标准品定性，脂肪酸含量表示为脂肪酸峰面积与总脂肪酸峰面积的百分比。

1.3.5脂质代谢相关基因表达量的测定

称取约150 mg肉样参考王宇[9]方法，采用TRIzol法提取苏尼特羊背最长肌RNA，并使用紫外分光光度计检测总RNA的纯度和质量浓度。利用TaKaRa公司的反转录试剂盒，进行反转录后cDNA置于-20 ℃保存备用。目的基因和管家基因的引物参照NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中提供的序列进行设计(表3)，由上海生工生物工程有限公司合成。按照SYBR Premix Ex Taq II试剂盒说明书操作。

表3 实时荧光定量PCR引物序列Tab.3 Primer sequence of real-time PCR

1.4 数据处理

利用SPSS 22.0软件选用单因素方差分析(ANOVA)进行多重比较(LSD、Duncan)，以P<0.05为显著性检验标准，所有数值均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 日粮添加乳酸菌对苏尼特羊肉品质的影响

日粮添加乳酸菌对苏尼特羊肉品质的影响见表4。pH值是评价肉品质的重要指标，动物屠宰后肌肉pH值下降会减弱肌肉中水与蛋白质的结合性，对肉质产生不利的影响。由表4可知，L组和C组苏尼特羊背最长肌pH0h值无显著性差异(P>0.05)；排酸24 h后，L组pH24h值显著高于C组(P<0.05)，说明乳酸菌能够减缓宰后肌肉pH值降低的速率[10]。同时，L组蒸煮损失显著低于C组(P<0.05)，研究表明，蒸煮损失与肉的保水性呈负相关，说明补充乳酸菌能够提高肌肉的保水性[11]。肉色是衡量肉品新鲜程度的重要指标之一，L*值是决定禽肉颜色的主要参数。L组苏尼特羊背最长肌L*值显著低于C组(P<0.05)，而a*值显著高于C组(P<0.05)，可能是由于乳酸菌能够增加高铁肌红蛋白的还原能力，减弱氧化能力，因此乳酸菌对改善苏尼特羊肉色具有积极作用[12]。剪切力能够客观反映肉的嫩度，实验结果表明：L组苏尼特羊背最长肌的剪切力显著低于C组(P<0.05)，其原因可能是乳酸菌参与机体脂质代谢，使脂肪沉积到内肌束膜，增加了结缔组织的松散度，最终改善了肌肉的嫩度[13]。

表4 乳酸菌对苏尼特羊肉品质的影响Tab.4 Effect of lactic acid bacteria on meat quality of Sunit sheep

肉的重要营养成分包括蛋白质、IMF、水分和灰分。IMF是影响肉品多汁性和风味的重要因素之一，实验结果表明，L组苏尼特羊背最长肌中IMF含量显著高于C组(P<0.05)。这说明乳酸菌可增加脂肪在肌肉中的沉积，以形成IMF，IMF中的磷脂能够进行脂质降解反应，产生挥发性香味物质，提升肉品质[14]。蛋白质、水分、灰分在2组间均无显著性差异(P>0.05)。

2.2 日粮添加乳酸菌对苏尼特羊脂质代谢的影响

2.2.1对苏尼特羊血脂代谢的影响

动物血浆中TC、TG、HDL- C以及LDL- C的含量是评价动物机体脂类代谢强弱的重要指标，乳酸菌对苏尼特羊血脂代谢指标的影响如图1。由图1可知，L组TG、HDL- C、LDL- C均显著低于C组(P<0.05)，可能的原因是乳酸菌促进机体脂类物质循环，充分将游离脂肪酸转化成不同的甘油三酯形式，阻碍TG进入到血液当中，降低血液中TG含量，同时有研究表明乳酸菌能够与HDL- C和LDL- C进行结合，通过小肠排出体外，从而减少血清中HDL- C和LDL- C的含量[15]。其他血脂指标2组间无显著性差异(P>0.05)。

小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。图1 乳酸菌对苏尼特羊血脂代谢的影响Fig.1 Effect of lactic acid bacteria on blood lipid metabolism of Sunit sheep

2.2.2对苏尼特羊脂肪酸组成的影响

日粮添加乳酸菌后苏尼特羊背最长肌脂肪酸的变化如表5。肉类肌肉中含有20多种脂肪酸，其中棕榈酸和硬脂酸为主要的饱和脂肪酸，油酸和亚油酸为主要的不饱和脂肪酸。由表5可知，2组苏尼特羊背最长肌中饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的占比并无显著性差异(P>0.05)，说明日粮添加乳酸菌对苏尼特羊背最长肌总脂肪酸的组成并无显著性影响。进一步研究发现，L组苏尼特羊背最长肌中癸酸占比显著低于C组(P<0.05)，但由于饱和脂肪酸的分子结构较为稳定，不易被氧化，因此不会对肉品质产生较大的影响[16]。相对于饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸存在双键结构，在加热过程中容易产生醛、酯、酮等风味物质，能够更直接地影响肉品质[17]。本研究表明：L组豆蔻油酸占比较C组提高了106.12%，其原因可能是乳酸菌抑制了瘤胃中部分氢化菌的活性，降低不饱和脂肪酸的氢化作用，增加了多不饱和脂肪酸在机体中的占比，使得日粮添加乳酸菌的苏尼特羊的脂肪酸组成更为合理，更有利于人体健康[18]。

表5 乳酸菌对苏尼特羊背最长肌脂肪酸组成的影响Tab.5 Effect of lactic acid bacteria on fatty acid composition of longissimus dorsi in Sunit sheep %

肉类中的膳食脂肪酸多为不饱和脂肪酸，如γ-亚麻酸是体内ω- 6系列脂肪酸代谢的中间产物，其转化成花生四烯酸的速率更快，具有广泛的生理活性和明显的药理作用[19]。花生四烯酸为必需脂肪酸，人体自身不能进行合成，只能通过食物摄取，具有免疫调节、降血脂等生理活性[20]。由表5可知，L组γ-亚麻酸、花生三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十四碳烯酸占比均显著高于C组(P<0.05)。说明整体上看，日粮添加乳酸菌能够促进苏尼特羊背最长肌中功能性脂肪酸的合成，其可能的原因为乳酸菌能够增加动物体内多种脂肪酸合成酶的活性，促进机体生成功能性脂肪酸[21]。有研究表明花生四烯酸的多少与动物肝脏微粒体的Δ6-脱饱和酶活性有关，且乳酸菌有利于增加Δ6-脱饱和酶活性，促进机体生成花生四烯酸[22]。因此，乳酸菌可用于修饰和改善畜肉脂肪酸特征，改变苏尼特羊脂肪酸图谱，提升苏尼特羊肉品质。

2.2.3对苏尼特羊脂质代谢相关基因表达量的影响

脂肪是动物体内能量的主要储存来源，在调控细胞膜结构和代谢产物前体物质上起重要作用，脂质代谢由众多基因参与并进行调控。日粮添加乳酸菌对苏尼特羊背最长肌脂质代谢相关基因表达量的影响如图2。由图2可知，日粮添加乳酸菌能够显著提高苏尼特羊背最长肌中ACC(acetyl-CoA carboxylase，乙酰辅酶A羧化酶)、PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、SREBP-1C(sterol regulatory element binding protein-1C，固醇调节元件结合蛋白1)基因的表达量(P<0.05)，显著降低AMPKα2(AMP-activated protein kinase α2，腺苷酸活化蛋白激酶α2)基因的表达量(P<0.05)，2组CPT1-B(carnitine palmitoyltransferase1-B，肉毒碱脂酰转移酶1)、FASN(fatty acid synthetase，脂肪酸合成酶)基因的表达量均无显著性差异(P>0.05)。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。图2 乳酸菌对苏尼特羊背最长肌脂质代谢相关基因 表达量的影响Fig.2 Effect of lactic acid bacteria on expression levels of lipid metabolism-related genes in longissimus dorsi of Sunit sheep

核激素受体是配体激活的转录因子，能够直接和间接调节脂质代谢的许多基因。PPARγ是核激素受体家族中的配体激活受体，也是脂肪的中枢基因调节因子，可刺激参与脂肪形成的多个基因的表达[23]。研究表明：日粮添加乳酸菌能显著提高PPARγmRNA表达量(P<0.05)，可能是乳酸菌增加了瘤胃中短链脂肪酸的沉积，脂肪合成底物含量增加，影响脂肪合成，这与Tian等[24]研究结果一致。此外，SREBP-1C也是脂质代谢中重要的核转录因子，能够调控脂肪酸和甘油三酯合成。Jalili等[25]利用嗜酸乳酸杆菌喂养大西洋鲑鱼发现嗜酸乳杆菌能以PPARγ依赖性方式诱导SREBP-1CmRNA表达，同时能激活PPARγ介导的脂肪合成通路，促进脂肪沉积。同时，PPARγ能够调控参与动物脂肪酸从头合成的FASNmRNA的表达。Sumlu等[26]研究认为补充瑞士乳杆菌能够通过提高FASNmRNA的表达量，恢复机体脂质蓄积，促进脂肪沉积，但本研究结果表明，L组苏尼特羊与C组FASNmRNA的表达量差异不显著(P>0.05)，可能是由于饲喂的乳酸菌种类不同。

*表示显著相关(P<0.05)，**表示极显著相关(P<0.01)。图3 苏尼特羊背最长肌中脂质代谢相关基因表达量与脂肪酸组成的相关性Fig.3 Correlation between expression of lipid metabolism-related genes and fatty acid composition in longissimus dorsi of Sunit sheep

AMPK(AMP-activated protein kinase，腺苷酸活化蛋白激酶)基因作为能量代谢的调控中枢，参与调节多种脂质代谢相关酶及转录因子。AMPK基因被抑制后能够改变脂质代谢的级联效应，抑制AMPK磷酸化能够促进ACCmRNA的表达，增加丙二酸单酰辅酶A活性，减弱CPT1-BmRNA的表达，抑制脂肪酸β-氧化，促进脂肪酸沉积[27]。由图2可知，日粮添加乳酸菌能够降低苏尼特羊背最长肌AMPKα2mRNA(P<0.05)和CPT1-BmRNA的表达量(P>0.05)，增加ACCmRNA的表达量(P<0.05)。其原因可能是乳酸菌降低了AMPK活力，AMPK-ACC信号通路被阻碍，CPT1- B活性被抑制，脂肪酸从头合成增加[28]。

2.3 脂质代谢对肉品质的影响

2.3.1脂质代谢相关基因表达量与脂肪酸组成的相关性分析

在脂肪合成和分解的过程中，脂肪酸代谢起着重要的作用，因此，对苏尼特羊背最长肌中脂质代谢相关基因表达量与脂肪酸组成进行相关性分析，见图3。由图3可知，AMPKα2 mRNA表达量与γ-亚麻酸、豆蔻油酸和花生四烯酸均呈显著负相关(P<0.05)，而ACCmRNA表达量与豆蔻油酸、γ-亚麻酸、花生三烯酸、花生四烯酸、二十四碳烯酸含量均呈极显著正相关(P<0.01)，FASNmRNA表达量与饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸呈显著正相关(P<0.05)。AMPK能够介导脂肪酸转移酶对细胞脂肪酸的摄入进行调控，而ACC和CPT1-B作为AMPK的下游基因能够对脂肪酸组成进行调控。研究表明ACCmRNA的高表达能够促进不饱和脂肪酸的沉积[29]，这与本研究结果一致，且Chang等[30]研究认为CPT1-BmRNA表达量与油酸含量呈正相关。因此，调控AMPK、ACC、CPT1-BmRNA的表达对苏尼特羊背最长肌中脂肪酸组成具有重要的影响。

*表示显著相关(P<0.05)，**表示极显著相关(P<0.01)。图4 苏尼特羊背最长肌中脂肪酸组成与肉品质的相关性Fig.4 Correlation between fatty acid composition and meat quality in longissimus dorsi of Sunit sheep

2.3.2脂肪酸组成与肉品质的相关性分析

肉中脂肪酸组成是决定肉品质的重要因素且关乎人类的营养健康。脂肪酸组成与肉品质的相关性分析见图4。由图4可知，L*值和b*值均与饱和脂肪酸含量呈极显著正相关(P<0.01)。有研究表明肌肉的红度与饱和脂肪酸呈现正相关[31]，本研究中红度与饱和脂肪酸含量呈正相关但不显著(P>0.05)，因此需要进一步研究。肌内脂肪与癸酸、肉豆蔻酸呈显著负相关(P<0.05)，与花生四烯酸和二十四碳烯酸呈显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)正相关。肌内脂肪是风味的前体物质，其主要成分为磷脂，富含多不饱和脂肪酸，能使肉呈现特殊的香味[32]。本研究结果表明：脂肪酸组成能够直接影响苏尼特羊肉品质，尤其是肉的色泽和肌内脂肪的营养价值水平。

3 结 论

将乳酸菌添加到日粮中能够增加苏尼特羊背最长肌中肌内脂肪含量，降低剪切力，提升肉的多汁性和嫩度。此外，日粮添加乳酸菌能显著降低苏尼特羊血液中甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇含量，改善血脂代谢水平。与对照组相比，日粮添加乳酸菌显著增加了苏尼特羊背最长肌中不饱和脂肪酸γ-亚麻酸、花生三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十四碳烯酸占比，优化了脂肪酸组成；同时，乳酸菌降低了苏尼特羊背最长肌中AMPKα2mRNA表达量，阻碍AMPKα2-ACC-CPT1-B信号通路，抑制相关基因表达，促进脂肪酸合成，提高苏尼特羊脂质代谢水平，改善了苏尼特羊肉品质。