李 晶,刘丽霞,高钦磊,刘彦彬,刘宇

(迪沙药业集团国家认定企业技术中心,威海 264200)

2,3-吡嗪二羧酸酐常用于制备吡嗪酰胺、吡咯酮类中间体,是镇静类药物佐匹克隆和右佐匹克隆的重要起始物料[1-4]。起始物料中的关键物质大多具有潜在的生物活性,有的甚至会与药物相互作用,从而影响药物的效能和安全性,甚至产生毒性作用[5-6]。为了保障人民群众的用药安全,国家特别重视原料药起始物料中有关物质的研究,并在化学药品新注册分类申报资料要求(试行)80号文中提出了相关要求。目前关于羧酸酐中有关物质检测方法的研究较少[7-8],原因可能为:相关研究主要关注主成分含量,且检测方法为滴定法,专属性差,不能用于有关物质的检测;2,3-吡嗪二羧酸酐化学性质不稳定,遇水易生成有关物质2,3-吡嗪二羧酸(杂质Q1-02),会干扰高效液相色谱法对杂质Q1-02的准确测定。因此,急需开发一种能够准确测定2,3-吡嗪二羧酸酐中有关物质含量的方法。

基于文献[9]可知,2,3-吡嗪二羧酸酐主要由原料苯并吡嗪经氧化、环合等两步反应得到,可能生成的杂质有杂质Q1-02、2-吡嗪甲酸(杂质Q1-03)。其中,杂质Q1-02是反应过程的中间体,杂质Q1-03由Q1-02氧化脱羧生成。2,3-吡嗪二羧酸酐与甲醇在室温条件下可衍生反应生成稳定化合物[10]。鉴于此,本工作在文献[11-13]的基础上,采用柱前衍生-高效液相色谱法测定2,3-吡嗪二羧酸酐中2,3-吡嗪二羧酸酐、杂质Q1-02 和Q1-03 的含量,并参照中华人民共和国药典(2015年版)要求进行了系统方法验证,方法准确度较高,解决了高效液相色谱法不能准确测定2,3-吡嗪二羧酸酐原料药中有关物质含量的技术性难题,可为2,3-吡嗪二羧酸酐原料药的质量监控提供方法指导。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

U3000型高效液相色谱仪,配变色龙7.0色谱工作站;DL-1000D 型智能超声仪;GM-0.33A 型隔膜真空抽滤泵;LTQXL 型液相色谱质谱联用仪;Milli-Q 型纯水仪。

杂质Q1-02对照品储备溶液:0.5 g·L－1,取杂质Q1-02对照品约5 mg,用70%(体积分数,下同)甲醇溶液超声溶解后定容至10 mL,摇匀备用。

杂质Q1-02 定位溶液:50 mg·L－1,分取1.0 mL杂质Q1-02 对照品储备溶液,用70%甲醇溶液稀释并定容至10 mL,摇匀备用。

杂质Q1-03对照品储备溶液:0.5 g·L－1,取杂质Q1-03对照品约5 mg,用70%甲醇溶液超声溶解后定容至10 mL,摇匀备用。

杂质Q1-03 定位溶液:50 mg·L－1,分取1.0 mL杂质Q1-03 对照品储备溶液,用70%甲醇溶液稀释并定容至10 mL,摇匀备用。

混合对照品溶液:50 mg·L－1,分别取杂质Q1-02、Q1-03对照品储备溶液各1.0mL置于10mL容量瓶中,用70%甲醇溶液稀释至刻度,摇匀备用。

主成分对照品储备溶液:取2,3-吡嗪二羧酸酐原料药100.01 mg,加入甲醇35 mL,超声20 min,取出后冷却至室温,用水定容至50 mL,摇匀即得。

系统适用性溶液:取2,3-吡嗪二羧酸酐原料药10.22 mg,加入杂质Q1-02、Q1-03对照品储备溶液各1.0 mL,甲醇5 mL,超声20 min,取出后冷却至室温,用水定容至10 mL,摇匀即得系统适用性溶液。

杂质Q1-02对照品的纯度不小于99.0%;杂质Q1-03对照品的纯度不小于99.9%;甲醇为色谱纯;三氟乙酸为分析纯;试验用水为超纯水;2,3-吡嗪二羧酸酐原料药纯度为97.8% (批号20170210,20170211,20170212),由某化工厂提供。

1.2 色谱条件

YMC Triart C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温30℃;流动相A 为0.5%(体积分数)三氟乙酸溶液,B 为甲醇;流量1.0 mL·min－1,梯度洗脱程度见表1;检测波长270 nm;进样量10μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.3 试验方法

取2,3-吡嗪二羧酸酐原料药约10.46 mg,加入甲醇7 mL,超声20 min,取出后冷却至室温,用水定容至10 mL,摇匀即得供试品溶液。按色谱条件测定其中3种目标物含量。

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件的选择

试验考察了样品与衍生化试剂甲醇的质量体积比(mg∶m L)分别为10∶5、10∶6、10∶7、10∶9,衍生时间分别为15,20,30 min时对2,3-吡嗪二羧酸酐衍生化程度以及有关物质色谱分离效果的影响。结果表明:当采用样品与衍生化试剂甲醇的质量体积比为10∶6时,供试品衍生不完全;当采用样品与衍生化试剂甲醇的质量体积比为10∶7 和10∶9时,供试品均能衍生完全,但体积比为10∶9时供试品溶液色谱图中杂质Q1-03峰形不好,仍然有溶剂效应影响。当甲醇超声衍生15 min时,衍生化反应未完全,降解杂质Q1-02 含量较高;当甲醇超声衍生20 min时,衍生化反应基本完全;超声衍生时间过长如30 min,可能导致2,3-吡嗪二羧酸酐与甲醇的衍生物发生水解。综上所述,试验选择样品与甲醇质量体积比为10∶7,衍生时间为20 min,2,3-吡嗪二羧酸酐衍生化完全且杂质Q1-02色谱峰峰形良好。

2.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对2,3-吡嗪二羧酸酐甲醇衍生物、杂质Q1-02与杂质Q1-03进行190～400 nm 内的全波长扫描。结果显示,三者分别在270.53,271.61,268.94 nm处有最大吸收。综合考虑,试验选择的检测波长为270 nm。

2.3 流动相水相中三氟乙酸体积分数的选择

试验考察了流动相水相中三氟乙酸的体积分数分别为0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%时对杂质Q1-03色谱峰的影响。结果显示:当水相中三氟乙酸的体积分数小于0.1%时,杂质Q1-03 色谱峰呈肩峰;继续增加三氟乙酸的体积分数,在0.3%～0.4%时杂质Q1-03色谱峰峰形分叉,在0.5%时杂质Q1-03 色谱峰尖锐、对称。因此,试验选择流动相水相中三氟乙酸的体积分数为0.5%。

2.4 专属性试验

按照色谱条件分析杂质Q1-02定位溶液、杂质Q1-03定位溶液与系统适用性溶液,其中系统适用性溶液的色谱图见图1。

图1 系统适用性溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of system suitability solution

结果显示:系统适用性溶液中杂质Q1-02、杂质Q1-03、2,3-吡嗪二羧酸酐衍生物的保留时间分别为7.507,13.103,21.217 min,其中前两者的保留时间与定位溶液所得Q1-02、Q1-03的保留时间(7.520,13.083 min)基本一致,说明溶剂、供试品溶液中主成分及其他杂质对杂质Q1-02、Q1-03 测定干扰较小;杂质Q1-02与杂质Q1-03、杂质Q1-03与2,3-吡嗪二羧酸酐衍生物的分离度分别为11.37和16.28,说明3种成分色谱分离效果较好,本方法的专属性较好。采用液相色谱-质谱法对各成分进行质谱解析,所得图谱见图2。

由图2 可知,质谱测得Q1-02 的分子离子峰[M＋H]＋为质荷比(m/z)169.024 3,与其理论值(分子式C6H4N2O4,相对分子质量168.02)一致;测得Q1-03 的分子离子峰[M ＋H]＋为m/z125.034 4,与其理论值(分子式C5H4N2O2,相对分子质量124.03)一致;测得2,3-吡嗪二羧酸衍生物的分子离子峰[M＋H]＋为m/z183.039 9,与其理论值(分子式C7H6N2O4,相对分子质量182.03)一致。

图2 系统适用性溶液的典型质谱图Fig.2 Typical mass spectra of system suitability solution

2.5 标准曲线与检出限

用70%甲醇溶液将主成分对照品储备溶液逐级稀释配制成2,3-吡嗪二羧酸酐质量浓度分别为400,600,800,1 000,1 200 mg·L－1的供试品溶液系列。用70%甲醇溶液分别将Q1-02对照品储备溶液,Q1-03对照品储备溶液逐级稀释配制成Q1-02 和Q1-03 质量浓度分别为40,60,80,100,120 mg·L－1的溶液系列。按照色谱条件测定杂质Q1-02、杂质Q1-03以及供试品溶液系列,以三者的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。所得线性范围、线性回归方程、相关系数见表2。

表2 线性参数Tab.2 Linearity parameters

逐级稀释系统适用性溶液,以能被可靠检出的质量浓度作为检出限,杂质Q1-02、杂质Q1-03以及2,3-吡嗪二羧酸酐的检出限分别为0.057 5,0.054 8,0.010 2 mg·L－1。

2.6 精密度试验

按照色谱条件平行测定供试品溶液和混合对照品溶液6次,计算2,3-吡嗪二羧酸酐、杂质Q1-02、杂质Q1-03测定值的相对标准偏差(RSD),所得结果分别为0.020%,1.3%,0(6次测定结果一致),说明方法精密度较好。

2.7 准确度试验

供试品中加入限度的80%,100%,120%的杂质Q1-02、杂质Q1-03,按照色谱条件平行测定9次,测得的回收率分别为95.2%,98.3%,测定值的RSD小于10%,均符合规定。

2.8 供试品溶液稳定性试验

将供试品溶液分别放置0,1,2,4,6,8,12 h后进样分析,结果显示,在放置12 h后,杂质Q1-02、杂质Q1-03测定值的偏差分别为0.82%,0.01%,而放置8 h后杂质Q1-02测定值的偏差小于0.20%,主成分及其他杂质均稳定。说明供试品溶液在8 h内稳定。

2.9 耐用性试验

略微调整检测波长、柱温、流量等参数,比较了在不同色谱条件下加标供试品溶液中杂质Q1-02、杂质Q1-03以及2,3-吡嗪二羧酸酐含量以及杂质Q1-03与2,3-吡嗪二羧酸酐的分离度的变化,结果见表3。

表3 耐用性试验结果Tab.3 Results of test for serviceability

结果显示:略微调整色谱参数,杂质Q1-03 与2,3-吡嗪二羧酸酐之间的分离度均大于15;杂质Q1-02、杂质Q1-03以及2,3-吡嗪二羧酸酐测定值的RSD 分别为1.2%,9.2%,0.12%,均小于10%,说明方法耐用性良好。

2.10 样品分析

按照试验方法分析3 批(批号分别为20170210,20170211,20170212)2,3-吡嗪二羧酸酐,测定各有关物质的含量。结果显示,2,3-吡嗪二羧酸酐的质量分数分别为97.93%,97.87%,97.83%,杂质Q1-02的质量分数分别为2.07%,2.13%,2.17%,杂质Q1-03未检出。其中批号20170210供试品的色谱图见图3。

图3 供试品的色谱图Fig.3 Chromatogram of the sample

本工作以甲醇衍生化2,3-吡嗪二羧酸酐,采用高效液相色谱法测定原料2,3-吡嗪二羧酸酐中2,3-吡嗪二羧酸酐、杂质Q1-02和杂质Q1-03的含量。该方法快速、有效、灵敏、专属性高,适用于2,3-吡嗪二羧酸酐中有关物质的快速批量测定,能够满足原料2,3-吡嗪二羧酸酐质量监控需求。