薛皓月,刘海龙,贾丽艳,郝璇,苏艳玲,荆旭*

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院,太谷 030801;2.山西颐天泰检测技术有限公司,临汾 041000;3.山西海雅堂食品有限公司,榆次 030600;4.晋中学院 生物科学与技术系,晋中 030619)

双酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚等酚类内分泌干扰物可用作增塑剂,以提高塑料产品(如微波炉饭盒、婴儿奶瓶和饮水机)的柔韧性、透明度和耐用性[1]。但这些酚类内分泌干扰物可能会从废弃的塑料材料中释放出来并进入到环境水体中,在水生生物中富集,进入食物链,进而危害人体健康[2]。体内和体外试验已证明,这些化合物可以模仿雌激素,破坏人类的生殖、神经、代谢、免疫和内分泌系统[3],对人类产生负面影响;流行病学研究表明,接触这些化合物是癌症发病率增加和人类生殖健康下降的重要因素之一[4-5]。因此,迫切需要开发一种简单、快速、准确的分析方法来测定水产品中内分泌干扰物的含量。

分散液液微萃取是高效的萃取和浓缩技术,分散行为增加了两相之间的接触表面,实现了分析物的快速萃取[6]。该方法简单、快速、高效,相比于固相萃取和液相萃取,消耗样品和溶剂少,富集系数高[7-8],但是其在萃取过程中会使用有毒的萃取剂,并且萃取剂相难以收集[9]。为了克服这些缺点,可使用绿色萃取溶剂来代替有毒溶剂以减少对环境的影响。

低共熔溶剂(DES)是一类由氢键供体和氢键受体依靠二者之间的氢键作用,按照一定化学计量比形成的两组分或三组分低共熔混合物[10-11]。本工作拟开发一种由香叶醇和癸酸合成的新型的绿色DES,该溶剂具有易合成、低成本、低毒性以及高生物降解性的优点[12-13]。大多数DES具有亲水性,很难应用于分散液液微萃取,而开发的新型绿色DES为疏水性,在从样本中提取分析物方面具有广泛的应用前景。此外,开发的新型绿色DES密度小、凝固点低,提取并离心后,萃取物漂浮在离心管的上端,然后在冰浴中转化为固相,将收集的萃取物在室温下解冻,以用于随后的仪器分析。作为绿色萃取剂的DES易于固化,可以大大减少萃取物收集的难度和收集过程中的潜在损失。

测定内分泌干扰物的方法一般有荧光光谱法[14]、紫外分光光度法[15]、高效液相色谱法[16]和气相色谱-质谱法[17]等。其中,高效液相色谱法具有操作简便、分析快速、成本低、易回收和应用范围广等优势。因此,本工作以香叶醇和癸酸合成的新型DES作为萃取剂,乙腈作为分散剂,结合水相形成三元混合体系,萃取富集水产品中的内分泌干扰物(双酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚),并采用高效液相色谱法进行测定。方法简单、快速、高效,适用于测定海参、鲍鱼和草鱼中内分泌干扰物残留量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪;DMT2500 型多管涡旋混合仪。

混合标准储备溶液:1 000 mg·L－1,分别准确称取双酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚标准品各10 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成质量浓度均为1 000 mg·L－1的混合标准储备溶液。

混合标准溶液:准确移取一定量的混合标准储备溶液,用甲醇逐级稀释成质量浓度为100,10 mg·L－1的混合标准溶液。用10 mg·L－1的混合标准溶液进行随后的试验。

混合标准溶液系列:准确移取一定量的混合标准储备溶液,用甲醇逐级稀释,配制成质量浓度分别为2.5,5,10,25,50,100 mg·L－1的混合标准溶液系列。

双酚A、4-叔辛基苯酚、壬基酚标准品的纯度均为99%,香叶醇、芳樟醇、癸酸、十一酸、十二酸和氯化钠均为分析纯;乙腈和甲醇为色谱纯;海参、鲍鱼和草鱼样品均购自当地海鲜市场。

1.2 色谱条件

Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);柱温20℃;流动相为体积比90∶10的甲醇-水的混合液;流量0.5 mL·min－1;进样量20μL;激发波长228 nm,发射波长305 nm。

1.3 试验方法

1.3.1 DES的制备

将癸酸和香叶醇在10 mL玻璃管中以2∶1的物质的量之比混合,然后将混合物在80℃水浴锅中加热,直至形成稳定的DES。冷却后在室温下储存。

1.3.2 样品预处理

称取已粉碎的1 g水产品样品于5 mL 离心管中,加入2 mL 乙腈,将离心管置于涡旋仪上,以转速2 000 r·min－1涡旋振荡3 min。取上清液400μL,经0.45μm 滤膜过滤。

1.3.3 样品测定

将100μL DES和400μL上述滤液混合,并迅速注入装有5 mL 80 g·L－1氯化钠溶液的10 mL离心管中,以完成DES的分散。将上述离心管以转速3 500 r·min－1离心5 min,然后置于冰浴中进行固化。将固化后所得样品溶解于150μL甲醇中,按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照试验方法测定混合标准溶液和草鱼、海参、鲍鱼等不同基质的空白样品溶液,所得色谱图见图1。由图1可知:在优化的色谱条件下,双酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚可得到较好的分离;草鱼、海参、鲍鱼等不同基质对样品的分析亦无干扰。

图1 混合标准溶液和不同基质的空白样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of the mixed standard solution and the blank samples with different matrices

2.2 DES种类的优化

试验以易合成、低成本、低毒性以及高生物降解性的DES作为萃取剂,使用癸酸、十一酸、十二酸分别与香叶醇、芳樟醇制备了不同种类的DES,在保持其他条件不变的情况下,考察了不同种类的DES对各内分泌干扰物回收率的影响,结果见图2。

由图2可知,以癸酸和香叶醇制备的DES作为萃取剂时,各内分泌干扰物的萃取回收率均较高。可能是因为这种DES氢键作用力强,黏度低,流动性大,更易分散于溶液中,进而提高了对目标物的萃取效率。因此,最终选择以癸酸和香叶醇制备的DES进行后续试验。

图2 DES种类对内分泌干扰物回收率的影响Fig.2 Effect of types of DES on recovery of endocrine disrupting chemicals

2.3 萃取条件的优化

以目标化合物的平均萃取回收率为优化指标,对DES组分的配比(A)、DES 体积(B)、乙腈体积(C)和氯化钠用量(D)进行四因素五水平正交试验,正交试验设计见表1,结果分析见表2。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2的极差分析可知,对内分泌干扰物的萃取回收率影响由大到小依次为DES 组分的配比(A)、DES体积(B)、乙腈体积(C)、氯化钠用量(D)。在萃取内分泌干扰物过程中,DES组分的配比(A)是一个重要的变量,这可能会影响DES的黏度、密度和固化能力,从而影响萃取能力[18]。DES 体积(B)也是影响萃取回收率的重要因素之一,通常足量的萃取剂会提取更多分析物,以确保回收率和足够的体积用于后续色谱分析。萃取剂用量应该尽可能低,以实现高富集倍数和灵敏度,其次,分散剂的体积也会影响目标物的萃取回收率,因此需要足够的分散剂以确保DES均匀地分散在样品溶液中,但是试验中过量的乙腈会影响目标物的分配系数。向样品中添加适量的氯化钠会降低分析物在水中的溶解度,促进分析物向有机溶剂的转移,从而提高萃取效率;但是添加过量的氯化钠会导致较大的静电相互作用,削弱它们转移至萃取相的能力,从而降低萃取回收率[10,19]。

表2 正交试验结果Tab.2 Results of the orthogonal experiment

综合极差分析结果,内分泌干扰物的最佳萃取条件组合是A2B2C2D3,即DES组分的配比(n癸酸∶n香叶醇)为2∶1,DES 体积为100μL,乙腈体积为400μL,氯化钠用量为400 mg。按照A2B2C2D3的条件对内分泌干扰物进行萃取,经过3次验证试验后,目标物的平均萃取回收率为91.4%。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按色谱条件测定混合标准溶液系列,以3种目标内分泌干扰物的质量分数为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,3种目标内分泌干扰物的质量分数在0.25～10μg·g－1内与对应的峰面积呈线性关系,具体的线性回归方程和相关系数见表3。

表3 线性参数Tab.3 Linearity parameters

按3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),按10倍信噪比计算测定下限(10S/N),所得内分泌干扰物的检出限均为0.075μg·g－1,测定下限均为0.25μg·g－1。

2.5 精密度试验

按试验方法对海参、鲍鱼、草鱼等3种水产品空白加标样品进行分析,每日平行测定5 次,共检测5 d,计算测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表4。

表4 精密度试验结果(n=5)Tab.4 Results of test for precision(n=5)

由表4可知,日内RSD 为0.72%～2.5%,日间RSD 为1.9%～3.8%。说明所建立的方法可获得良好的精密度和重复性。

2.6 样品分析及回收试验

为了考察该方法对于实际样品的可行性,首先测定实际样品海参、鲍鱼和草鱼中目标内分泌干扰物双酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚的含量,平行测定5次,并进行加标回收试验。结果表明,实际样品海参、鲍鱼和草鱼中目标内分泌干扰物双酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚的含量均低于检出限;计算回收率结果见表5。

表5 回收试验结果Tab.5 Results of test for recovery

由表5可知:在海参、鲍鱼和草鱼中双酚A 的回收率为78.8%～84.4%;在海参、鲍鱼和草鱼中4-叔辛基苯酚的回收率为79.1%～91.6%;在海参、鲍鱼和草鱼中壬基酚的回收率为78.7%～90.8%,表明该方法具有良好的准确度和适用性。

本工作提出了一种基于新型DES的分散液液微萃取-悬浮固化-高效液相色谱法测定水产品中内分泌干扰物残留量的方法。首次将香叶醇和癸酸以不同的比例合成新型的疏水性DES,可有效地从样品溶液中提取内分泌干扰物。DES在冰浴中固化,以促进其从水溶液中分离,简单且快速,利于萃取剂的收集。该方法简单、高效、绿色,已成功应用于测定海参、鲍鱼和草鱼样品中的内分泌干扰物的含量,并有可能在未来的研究中应用于其他有害物质的萃取和测定。