陈瑞琦，闫伊狄，代媛媛，孟 鑫

（锦州医科大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121000）

近年来，风味酶已广泛应用于乳制品、肉制品、葡萄酒和饮料中，如脂肪酶、木瓜蛋白酶等[1]。脂肪酶作为一种可以催化油脂等疏水性底物的水解、酯化、转酯化、氨解等多种反应的重要风味酶，已应用于能源、医药、洗涤、食品等诸多领域。在肉品中应用脂肪酶可以有效改善肉的风味。宋诗清等[2]研究表明，经过酶解和温和加热控制鸡脂氧化后，鸡肉风味突出，肉味醇厚持久，异味明显减少。试验前期研究从猪肉中提取的内源性脂肪酶，对鸡肉、猪肉等肉品风味有明显的改善作用[3]，并在酿酒酵母中表达了重组脂肪酶基因，发现重组猪肉脂肪酶对典型肉类及奶制品的风味的提高有一定的作用[4]。

然而，脂肪酶对环境敏感，易失活，成本高，催化效率低，严重限制了其在食品工业和其他领域的应用[5-6]。将酶固定在某些载体上制成固定化酶，再通过回收载体同步回收酶，能够有效降低其生产成本，是目前脂肪酶连续工业化生产的有效方式[7-8]。传统固定化技术多采用共价-交联、吸附、包埋等方法，为了更好地满足社会和生产需求，国内外学者已采用新型、绿色食品级材料生产固定化酶制剂。尹春华等[9]采用植物乳杆菌合成了纳米氧化锌粒子，并用于脂肪酶的固定化，发现固定化酶的pH和温度的稳定性得到显著提高，具有良好的可重复使用性。Maryellen等[10]研究发现，卵磷脂和MgCO3对聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球包裹碳酸酐酶活性有影响。2014年，邓涛[11]首次提出以改性核桃壳作为载体固定化脂肪酶的制备方法，使脂肪酶的热稳定性得到较大的提高。王挥等[12]选用LX-1000HA树脂为载体固定化单宁酶，提高了单宁酶的热稳定性和pH耐受性。为了提高猪肉内源性脂肪酶的可重复使用性，本试验以微球酶、改性核桃壳固定化脂肪酶和LX-1000HA树脂固定化脂肪酶3种方法进行固定化，以期筛选出一种绿色脂肪酶固定化生产工艺。

随着生活质量的不断提高，人们不仅追求肉品的营养价值，而且对肉品的风味品质也有越来越高的要求[13-14]。鸡肉因其高蛋白、低脂、低胆固醇的特点深受消费者青睐，是我国主要肉类品种之一[15-16]。因此，改善鸡肉及其相关制品风味尤为重要。本试验从3种方法中筛选出制备固定化脂肪酶的最佳工艺，并将其添加到鸡肉中，采用电子鼻和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）检测鸡肉风味物质经固定化猪肉内源性脂肪酶处理前后的变化，为肉品风味的研究奠定理论基础，并为肉制品深加工提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

猪肉内源性脂肪酶（以下简称脂肪酶），上海弘顺生物科技有限公司；生核桃壳，购买于锦州大润发；LX-1000HA树脂，西安蓝晓生物科技有限公司；Span 20、矿物油、戊二醛、乙二胺、三丁精、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（KH-570）、聚乙二醇二缩水甘油醚，天津索罗门生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯，市售品。

1.1.2 仪器与设备

RE-2000A马弗炉，沈阳市长虹工业电器厂；PEN3电子鼻，德国AIRSENSE公司；顶空固相微萃取器（SPME）、75μm CAR/PDMSSPME萃取头，德国达姆施塔特默克集团；GL570气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；S-3400型扫描电镜，北京中科科仪股份有限公司；V-5000型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微球酶的制备

制备50 mg/mL脂肪酶溶液并过滤，收集过滤后的脂肪酶溶液备用，取上述脂肪酶溶液2 mL作为水相。乳化前，在水相中加入500μL三丁精作为酶活性位点保护剂，三丁精的最终浓度为酶溶液的25%（体积分数），再加入500μL Span 20作为表面活性剂。之后，向混合物中添加50 mL矿物油，混合液在1 500 r/min条件下乳化1 min，乳化前在酶溶液中加入交联剂戊二醛，戊二醛添加量为酶溶液的16.7%（体积分数），水相中加入300μL交联剂（等体积乙二胺和戊二醛预混15 min后加入反应体系），乳化后静置2 h。用离心法收集聚合后的微球酶[17]。为了纯化微球酶样品，此过程重复5次。

1.2.2 改性核桃壳固定化猪肉内源性脂肪酶

1.2.2.1 载体的制备

将核桃壳烘干、粉碎，取10 g核桃壳粉末，加50 mL磷酸溶液，在60℃水浴锅中浸渍15 min，过滤将其送入马弗炉，先在300℃下炭化90 min，再在600℃下活化90 min，活化结束后，用0.1%盐酸清洗并用蒸馏水洗涤至中性，最后烘干，常温保存备用[18]。

1.2.2.2 载体的表面氧化

取载体5 g，加入20%硝酸溶液50 mL，在80℃的水浴锅中浸渍3 h。过滤后，加入离子水煮沸，过滤，然后干燥4次[18]。

1.2.2.3 载体的表面硅烷化

取1 g氧化后的载体于100 mL无水乙醇中超声分散1 h后，加入一定量的0.01 mol/L盐酸，调节pH值至4.0，再加入3%KH-570溶液，60℃水浴反应24 h，过滤，滤饼分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤，除去未反应的KH-570，烘干[18]。

1.2.2.4 固定化酶的制备

取1.0 g改性的载体于三角瓶中，加入5 mL质量浓度为50 mg/mL的脂肪酶酶液，在摇床上振荡一定时间使载体吸附固定脂肪酶。经抽滤、去离子水洗涤、冷冻干燥，得到固定化脂肪酶[18]。

1.2.2.5 核桃壳载体傅里叶变换红外吸收光谱仪（FT-IR）的测定

KBr压片法制样：将未改性核桃壳和改性核桃壳分别与一定量的KBr于研钵中充分研磨成均匀粉末，压制成薄片。样品进行全波段扫描（4 000～400 cm-1），扫描次数为32次，分辨率为4 cm-1，每个样品重复试验3次。

1.2.2.6 电镜的测定

分别取3 g未改性核桃壳和改性核桃壳为样品，再分别取10 mL游离脂肪酶酶液和固定化的脂肪酶酶液经冷冻干燥成粉末状样品。使用S-3400型扫描电镜分析4种样品的表面形态，工作电压为3 kV，喷金后观察其表面形态。

1.2.3 LX-1000HA树脂固定化猪肉内源性脂肪酶

1.2.3.1 载体活化

湿载体LX-1000HA树脂在30℃烘干备用，加入交联剂聚乙二醇缩水甘油醚，在摇床中振荡处理载体，除去残留的交联剂。

1.2.3.2 脂肪酶固定化

将脂肪酶酶液加入到活化后的载体中，摇床振荡固定化，用缓冲液进行洗涤，抽滤，除去残留酶液，测定酶活性[19]。

1.2.4 固定化脂肪酶活性测定

在相同条件下，即：酶浓度为50 mg/mL，缓冲液pH值为6.0，固定化时间为3 h，固定化温度为35℃。用3种不同方法固定化脂肪酶，以游离脂肪酶为空白对照，比较不同方法固定的脂肪酶活性大小。

采用改进的铜皂法测定。在试管中加入2 mL橄榄油乳化液和2.5 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.5），40℃水浴中加热5 min后加入0.5 mL待测酶液，充分混匀后水浴振荡15 min，然后立即加入1 mL 6 mol/L盐酸溶液和6 mL 95%乙醇溶液，混合后加入3 mL异辛烷，并完全振荡90 s。然后于60℃下静置10 min，待冷却后，取1 mL异辛烷上清液放入新的试管中，再加入4 mL异辛烷和1mL铜盐显色剂，混匀后静置，取上清液，用紫外可见分光光度计于714 nm处测定其吸光度，根据标准曲线计算脂肪酶活力[20]。酶活力单位（U）定义为：在上述反应条件下1 min内转化出1μmoL脂肪酸的酶量称为1个脂肪酶活力单位。

1.2.5 风味检测

1.2.5.1 原料肉的处理

在常温pH 6.5的条件下，取10 mL蒸馏水和25 g鸡肉样品，二者充分混合浸泡30 min（样品A）；分别取游离酶酶液和改性核桃壳固定化酶酶液10 mL，与25g鸡肉样品充分混合浸泡30min（样品B和样品C）。每组分别置于300 mL沸水中单独煮制2 min，备用。

1.2.5.2 电子鼻检测

将上述3组样品分别取4 g，切碎放入烧杯中，迅速加盖密封，20 min后进行测量。电子鼻信号的采集时间为60 s，清洗时间为120 s[21]。PEN3型便携式电子鼻传感器性能描述见表1。

表1 PEN3型便携式电子鼻传感器的特点Table 1 Characteristics of PEN3 portable electronic nose sensor

1.2.5.3 GC-MS分析

固相微萃取：分别取样品A、B、C各4 g，切碎，煮熟后迅速放入20 mL顶空瓶中，快速加盖进行GC-MS检测，每组样品做2次平行试验。加入4 mL饱和氯化钠溶液及磁转子，用聚四氟乙烯隔垫密封，在磁搅拌器中45℃加热10 min。用活化的萃取头（270℃活化60 min）顶空吸附35 min后，然后将萃取头插入进样口解吸5 min。每个样品重复试验3次[22]。

气相色谱条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；进样口温度为250℃，不分流模式进样；载气为He，流速1.0 mL/min；程序升温，毛细管柱初温40℃，保持3 min，然后以3℃/min升至100℃，再以5℃/min升至230℃，保持5 min。

质谱条件：色谱-质谱接口温度280℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃；离子化方式：EI；电子能量70 eV；质量扫描范围30～550（m/z）。

1.2.6 数据处理

所有结果均为3次重复的平均值，使用Microsoft Office2013软件绘制图。采用电子鼻自带的Alpha Soft软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 3种不同固定化方法处理后的猪肉内源性脂肪酶活力测定结果

采用3种不同的方法固定化猪肉内源性脂肪酶，结果如图1所示。与其他两种方法相比，改性核桃壳固定化的脂肪酶活最高，达169.8 U/g。

图1 酶活力测定结果Fig.1 Determination resultsof enzyme activity

改性核桃壳法固定化脂肪酶是以核桃壳为原料，采用磷酸活化法将核桃壳制备成核桃壳活性炭。活性炭孔隙发达，且具有较好的机械强度，是一种非常适合制备固定化酶的载体；通过表面氧化和硅烷化对其进行改性处理后，使表面连接了疏水性有机官能团，将脂肪酶“盖子”打开，并借助载体来固定化脂肪酶，以此降低游离脂肪酶的失活率，提高固定化酶活力[18]。此外，因核桃壳来源丰富，成本低廉，绿色安全，与微球酶法和LX-1000HA树脂法相比，改性核桃壳法固定化脂肪酶更绿色、环保，适于食品加工生产。

2.2 FT-IR结果

图2为载体改性前后的FT-IR谱，可以看出，核桃壳载体中含大量的亲水基团，如羟基、羧基、环氧基和羰基。样品在3 200～3 500 cm-1处的吸收峰是载体表面的羟基基团及其吸收的水分子中的羟基，1 600 cm-1附近处的吸收峰是芳基羧酸中羰基的伸缩振动吸收峰，1 100 cm-1对应于仲醇中O-H或醇、酚中C-O或C-O-C的振动。除此之外，相比未改性核桃壳载体，改性后核桃壳载体的吸收峰中有来自于KH-570中的甲基、亚甲基伸缩振动，这表明改性后的载体引入了KH-570基团。在3 500 cm-1处，改性载体的吸收峰比未改性载体弱，这可能是由于在还原和后处理过程中烷氧基进一步水解缩合形成更多的Si-O-Si键，包裹在了改性载体表面，表明改性后载体成功地将硅烷化试剂修饰到载体上。

图2 FT-IR结果Fig.2 FT-IRresults

2.3 电镜结果

由图3可以看出，未改性核桃壳载体（图3A）以及改性核桃壳载体（图3B）的孔系均比较发达，表面可见许多大小不等的孔，但未改性核桃壳载体表面非常粗糙，在载体改性后其表面变得光滑，表明载体经氧化及硅烷化后形态发生了改变。

观察游离脂肪酶（图3C）以及固定化的脂肪酶（图3D）可以发现：游离脂肪酶以微小的球体形态存在，当游离的脂肪酶被改性核桃壳固定化后会吸附在核桃壳的孔隙上，达到固定化的作用。

图3 SEM结果Fig.3 SEMresults

2.4 电子鼻检测改性核桃壳固定化猪肉内源性脂肪酶对鸡肉风味的影响

处理前的鸡肉样品、经游离脂肪酶和改性核桃壳固定化脂肪酶处理后的鸡肉样品的传感器响应变化曲线如图4所示。3组样品中，曲线变化趋势整体相同，但相对电阻率（G/G0）大小发生了改变，表明经固定化脂肪酶处理前后，鸡肉中挥发性风味物质种类没有改变，只是部分物质在含量上有不同程度变化，这与同类文献结果相似[23-24]。其中，R7传感器代表的含硫化合物和R9传感器代表的芳香族类化合物有明显变化，而这些化合物是影响肉品风味的主要物质。由此可知，经改性核桃壳固定化处理后的脂肪酶和游离的猪肉内源性脂肪酶具有相同的催化作用，均能够有效改善鸡肉样品的风味。

图4 鸡肉样品处理前后传感器响应变化曲线Fig.4 Response chang curveof sensor for chicken sample before and after treatment

通过多次预试验得出电子鼻检测在50 s之后开始趋于稳定，为了确保数据的准确性和稳定性，选取57～60 s作为特征值的提取时间点，并对数据进行主成分分析（PCA）。主成分分析是一种有效简化数据的工具，主要是降低数据维数，简化原始数据。处理前的鸡肉样品以及分别经游离脂肪酶和改性核桃壳固定化脂肪酶处理后的鸡肉样品中的挥发性风味物质的电子鼻PCA分析结果见图5。

图5 鸡肉样品处理前后响应值PCA分析图Fig.5 PCA analysisdiagramof response value for chicken samples before and after treatment

图中的每个椭圆代表同批次鸡肉风味的数据采集点，数据点越接近，样品的重复性越高。主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的贡献率分别为98.91%和1.06%，总贡献率为99.97%，表明两个主成分能够反映原始数据的信息。在PCA图中，3组样品在横坐标上的间距越大，说明其差异越大。主成分2的贡献率较主成分1的贡献率小，所以可以将其忽略。样品的差异性主要表现在PC1上。PCA分析可以看出，不同处理对鸡肉样品中挥发性成分有明显的影响，但利用PCA不能很好地区分3组鸡肉样品之间的挥发性成分[25-27]。为进一步明确3组样品的鸡肉挥发性物质增加的具体成分，采用GC-MS进行分析检测。

2.5 GC-MS检测改性核桃壳固定化猪肉内源性脂肪酶对鸡肉风味的影响

由图6可见，通过HS-SPME-GC-MS检测3组样品鸡肉风味的差异，发现3组样品共检测出挥发性物质53种，主要包括醛类、烃类、芳香族类、酯类、醇类和含硫化合物等。从样品A、B和C中各类挥发性物质成分总峰面积的变化能够看出，GC-MS检测发现了脂肪酶固定化处理对肉品风味有明显响应，与样品A相比，样品B和样品C的挥发性化合物种类和含量均发生改变，且响应值各不相同，醛类、芳香族化合物和含硫化合物含量增加，有机酸类和烃类物质等含量降低。

2.5.1 醛类化合物

醛类化合物是重要的羰基化合物，来自于脂肪氧化，一般阈值较低，特别是C6～C10醛类化合物具有脂肪香味，是所有熟肉制品中最重要的挥发性风味物质。其中正己烷的阈值较低，具有青草香和叶香，是脂肪氧化的标志性产物，也是评价肉类和肉类产品氧化状态和风味品质的可靠指标[28-29]。3组样品共同检测到的醛类有己醛、辛醛、对甲氧基苯甲醛、(E)-2-辛烯醛、苯甲醛、壬醛、苯乙醛。其中，相对质量分数最高的是对甲氧基苯甲醛，它又称为茴香醛，有似茴芹和山楂的香气；相对质量分数较高的饱和醛还有己醛、3-甲硫基丙醛、乙醛、壬醛、辛醛。由图6可知，3组样品中醛类化合物的相对含量分别为15.13%、40.2%和44.05%，表明固定化脂肪酶处理促进了鸡肉样品香气的增加。

图6 鸡肉样品处理前后挥发性成分相对含量的比较Fig.6 Comparison of relative contentsof volatile componentsin chicken samplesbefore and after treatment

2.5.2 芳香族类化合物

形成杂环化合物的重要中间体物质中有些来源于芳香族类化合物，这些芳香族类化合物能够提高食品的整体风味。熟鸡肉的主要香气成分就是芳香化合物。3组样品中均检出甲苯、1,5-二甲基-4,8-二乙基双环苯和2-乙酰氧基甲基-3-亚甲基联苯3种芳香族类化合物。3组样品中芳香族类化合物的相对含量分别为5.14%、21.3%和24.37%，该类化合物含量在固定化脂肪酶处理后的鸡肉样品中有所提高，对整个香气增加有一定的贡献。

2.5.3 醇类和酯类

脂肪酸降解及氧化分解脂肪所产生的物质是获得醇类物质的主要途径。醇类分为短链醇和长链醇，低阈值的醇类尤其是长链醇，如1-辛烯-3-醇，可以很大程度改变鸡肉风味[30]。酯类化合物对风味也有影响，其中大部分具有蜂蜜香气和水果香气，可以改善肉品的风味。由图6可知，3组样品中醇类和酯类化合物的相对含量分别为18.64%、9.23%和8.02%。

2.5.4 酮类化合物

鸡肉样品中主要检出的酮类化合物有丙酮、2,3-丁二酮等。酮类物质通常由多不饱和脂肪酸氧化、美拉德反应、氨基酸降解或微生物氧化所产生[31]。由图6可知，3组样品中酮类化合物的相对含量分别为23.56%、23.40%和26.24%，其中4-甲基-2-戊酮仅在样品B和样品C中检出。

2.5.5 烯烃类

烯烃主要来自脂肪酸烷氧自由基的均裂，一般被认为对香气无特殊贡献，但有些可能是形成杂环化合物的重要中间体，有助于提高整体风味[32-33]。由图6可知，3组样品中烯烃类化合物的相对含量分别为38.53%、31.11%和27.65%，共同检测出右旋萜二烯，它存在于柠檬、薄荷等多种精油中，具有令人愉快的柠檬香气[34]。样品中还检测出了较多的烯烃和支链烷烃，其对整个香气的和谐有一定的贡献。

2.5.6 含硫化合物

含硫化合物的阈值低，主要来自氨基酸和还原糖之间的美拉德反应，氨基酸热溶液的降解和硫氨素的降解，经醇醛缩合、醛胺聚合生成，它多有硫磺香气、洋葱似的香气，大部分有肉的香味。由图6可见，样品A、B、C中含硫化合物的相对含量分别16.34%、23.43%和25.28%，说明固定化脂肪酶处理对鸡肉样品风味的提升有重要作用。

3 结论

在同一条件下，以微球酶、改性核桃壳固定化脂肪酶和LX-1000HA树脂固定化脂肪酶3种方法进行固定化，改性核桃壳固定化脂肪酶的活力最高，为169.8 U/mL。电子鼻检测结果表明，经改性核桃壳固定化脂肪酶处理后，鸡肉中挥发性风味物质种类没有改变，只是部分物质在含量上有不同程度变化。其中，R7传感器代表的含硫化合物和R9传感器代表的芳香族类化合物有明显变化，由此可知，经改性核桃壳固定化处理后的脂肪酶和游离脂肪酶具有相同的催化作用，均能够有效改善鸡肉样品的风味。HS-SPME-GC-MS检测发现，与未经酶液处理的鸡肉相比，经核桃壳固定化脂肪酶处理后的鸡肉样品挥发性成分主要有醛类、烃类、芳香族类、含硫化合物、有机酸，以及醇和酯类等物质，其中，醛类、芳香族类和含硫化合物类物质相对含量有所提高，有机酸类和烃类物质含量降低。以上研究结果表明：采用改性核桃壳固定化猪肉内源性脂肪酶处理鸡肉可以有效增加鸡肉的香气，提高肉品风味。研究为固定化脂肪酶在肉制品中的应用提供了一定的理论依据。