严玉婷，李玉杰，王倩，唐美君，郭华伟，李红亮，孙亮*

化学感受蛋白直系同源基因在茶尺蠖及近缘种灰茶尺蠖中的表达分析

严玉婷1,2，李玉杰2,3，王倩4，唐美君2，郭华伟2，李红亮1*，孙亮2*

1.中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，浙江 杭州 310018；2.中国农业科学院茶叶研究所/农业农村部茶叶质量安全控制实验室，浙江 杭州 310008；3.河南科技学院植物保护系，河南 新乡 453003；4.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300

化学感受蛋白（Chemosensory proteins，CSPs）在昆虫化学通讯及其他生理过程中发挥重要功能。茶尺蠖与其近缘种灰茶尺蠖是茶园重要鳞翅目害虫，对我国茶叶的安全生产造成严重危害。研究化学感受蛋白直系同源基因在茶尺蠖两近缘种间的表达，有助于研发同时针对该两种害虫的绿色防控技术。通过荧光定量qRT-PCR分析了直系同源基因在灰茶尺蠖中的表达分布。结果表明，与具有保守的幼虫期高表达模式，主要表达于灰茶尺蠖3龄幼虫头部。进一步比较在茶尺蠖两近缘种间的表达发现在茶尺蠖中的表达量显著高于在灰茶尺蠖中的表达量。此外，还分析了沃尔巴克氏体菌（）及挥发物诱导对表达的影响，发现显著影响在灰茶尺蠖中的表达。该结果证实参与调控昆虫CSPs基因的表达，为后续揭示介导CSPs表达，参与调控茶尺蠖两近缘种化学感受及与茶树的协同进化提供了新的研究思路。

茶尺蠖；灰茶尺蠖；化学感受蛋白；；表达分析

高度灵敏的嗅觉系统对昆虫寄主定位、取食选择、交配繁衍及躲避天敌等行为活动至关重要。触角是昆虫最重要的感受器官，其表面分布有多种类型的化学感受器感知外界化学信号[1]。外界信号分子主要通过感器表面的微孔进入嗅觉感器淋巴液。脂溶性的气味分子无法直接穿过水溶性的感器淋巴液激活气味受体（Odorant receptors，ORs），载体蛋白如气味结合蛋白（Odorant binding protein，OBPs）、化学感受蛋白（Chemosensory protein，CSPs）在昆虫感器淋巴液中大量表达，能够选择性的识别、结合运输气味分子穿过亲水性的感器淋巴液至感觉神经元树突，激活气味受体，最终引发昆虫相应的行为反应[2]。

CSPs被发现可在沙漠蝗（）的接触感器中表达，推测其具有化学感受功能，因而被命名为化学感受蛋白[3]。CSPs是一类水溶性小分子蛋白，分子量一般为10～15 kDa，具有4个半胱氨酸，可形成两个二硫键。CSPs可以在昆虫的各个组织广泛表达，涉及调控昆虫的多种生理过程[4]。例如NlugCSP10在褐飞虱（Stål）的多个发育时期表达，体外结合试验与基因干扰证实NlugCSP10参与褐飞虱的感受识别顺-3-己烯乙酸酯等寄主植物挥发物[5]。苜蓿盲蝽（Goeze）CSPs被证实能够表达于多种化学感器的淋巴液，结合盲蝽性信息素及植物挥发物，推测其具有化学感受功能[6]。家蚕（）CSPs可在杀虫剂诱导下显著上调，可能具有除化学通讯以外的其他功能[7-8]。此外，CSPs还被证实可参与东亚飞蝗（）的行为相变[9]、蜚蠊（）足的再生[10-11]，以及红火蚁（ta）的脱皮代谢等[12]。

茶尺蠖（Prout）与灰茶尺蠖（Warren）是茶园鳞翅目尺蛾科的一对近缘种害虫，二者形态相似，均以幼虫取食叶片危害茶树[13]。近年来两近缘种在我国局部茶区频繁暴发，对茶叶安全生产和品质造成严重威胁。研究表明茶尺蠖两近缘种在地理分布、生长发育历期、求偶交配等方面存在明显差异。茶尺蠖主要分布在浙江、江苏和安徽等地茶园，灰茶尺蠖分布范围更广，二者存在混合发生区域[14-15]。灰茶尺蠖世代发育历期比茶尺蠖短，发育速率也较茶尺蠖快，繁殖能力更强[16]。此外，二者存在明显的生殖隔离和生殖竞争[17-18]，两种尺蠖雌蛾合成释放的性信息素在组分和比例上存在差异[19]。共生菌尤其是沃尔巴克氏体菌（）在两近缘种间的携带率也显著不同；利用快速进化基因外膜蛋白基因wsp分子检测发现，主要在灰茶尺蠖中，茶尺蠖几乎不携带[20]。四环素等抗生素处理茶树叶片饲喂幼虫，可以去除灰茶尺蠖体内的，建立不携带的灰茶尺蠖突变体种群[21]。

本实验室前期研究鉴定了14个茶尺蠖化学感受蛋白基因，并明确了其在茶尺蠖中的发育时期及组织表达分布，其中被证明能够表达于茶尺蠖的3龄幼虫[22]。为鉴定两近缘种幼虫表达的化学感受蛋白，筛选重要的靶标功能基因调控幼虫与茶树互作行为，本研究继续聚焦，采用实时荧光定量PCR技术着重研究直系同源基因在灰茶尺蠖中的表达分布及其在两近缘种间的表达差异，旨在为后续揭示茶尺蠖两近缘种与茶树互作的化学通讯机制，研发针对两近缘种幼虫的绿色防控技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

茶尺蠖幼虫采于浙江省安吉县（119.31°E，30.27°N），野外采集的茶尺蠖幼虫根据前期研究报道进行分子鉴定确定种属关系[18]。在实验室建立茶尺蠖种群，温度为(25±1)℃、光周期为L∶D=13∶11、相对湿度75%～80%。幼虫用新鲜的茶树叶片饲喂，化蛹后在显微镜下按雌雄分开。将新羽化的雌雄蛾配对交配，待雌蛾产卵后，收集试虫卵条保存于4℃冰箱备用。灰茶尺蠖以及利用四环素处理去除共生菌的突变体（以下简称灰茶尺蠖突变体）种群已在实验室繁殖饲养多代，饲养方法与上述茶尺蠖相同。

为研究共生菌对靶标基因表达量的影响，本研究试样收集前，根据前期研究报道，对灰茶尺蠖及灰茶尺蠖突变体种群进行携带检测验证，确保灰茶尺蠖突变体种群中共生菌被去除[23]。

1.2 组织样品收集

1.2.1 灰茶尺蠖各个发育时期样品收集

为研究直系同源基因在灰茶尺蠖的各个发育时期的表达分布，分别取灰茶尺蠖卵（200粒）、3龄幼虫（15头）、雌雄虫蛹（0～1 d）各30头、未交配雌雄蛾（羽化0～1 d）各15头。每个样品收集3个生物学重复，样品经液氮冷冻后迅速转移至–80℃冰箱备用。

1.2.2 灰茶尺蠖3龄幼虫各组织样品收集

为研究在灰茶尺蠖3龄幼虫各组织的表达情况，取20头灰茶尺蠖3龄幼虫进行解剖，分别收集幼虫头部、中肠、表皮及脂肪体，每个组织样品至少收集3个生物学重复。收集样品于液氮中冷冻后迅速转移至–80℃冰箱备用。

1.2.3 茶尺蠖、灰茶尺蠖及灰茶尺蠖突变体3龄幼虫样品收集

为研究直系同源基因在茶尺蠖两近缘种间是否存在表达量的差异，并分析其与的相关性，分别收集茶尺蠖、灰茶尺蠖及灰茶尺蠖突变体3龄幼虫。收集30头幼虫头部作为1个生物学重复，重复3次，样品于液氮冷冻后迅速转移至–80℃冰箱备用。

1.2.4 挥发物诱导试虫样品收集

有研究指出，茶树挥发物顺-3-己烯-1-醇参与茶尺蠖与茶树互作调控[24-25]，本研究选择顺-3-己烯-1-醇（纯度＞97%）作为诱导挥发物，分析茶尺蠖两近缘种被诱导后体内的表达量变化。

取20头3龄茶尺蠖幼虫置于500 mL玻璃养虫瓶中，瓶内放置2～3片茶树叶片。取10 μL溶于石蜡的1 μg·μL-1顺-3-己烯-1-醇加到3 cm×4 cm的滤纸条内，将滤纸条置于茶树叶片中。玻璃瓶口用正方形的梨酸纸封口，再用直径9 cm的培养皿盖在瓶口，减少空气流通。对照组将挥发物换成石蜡，其他条件与处理组相同。处理4、8、12 h后分别从处理组和对照组取5头幼虫作为1个样品重复，共收集3个生物学重复。试虫样品经液氮速冻后转移至–80℃冰箱保存备用。灰茶尺蠖试虫处理方法与茶尺蠖相同。

1.3 总RNA提取及第一链cDNA合成

将样品在灭菌的研钵中用液氮充分研磨，加入Trizol（Invitrogen），按照Trizol法提取样品总RNA。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。利用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo，美国）测定总RNA的浓度。经检测验证的各组织总RNA于–80℃冰箱保存备用。

利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司]进行第一链cDNA的合成。第一步10 μL反应体系：2.0 μL 5×gDNA Eraser buffer，1.0 μL gDNA Eraser，6.0 μL ddH2O，1.0 μL RNA，42℃反应2 min，4℃保存备用。第二步10 μL反应体系：4.0 μL 5×PrimeScript Buffer，1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0 μL RT Primer Mix，4.0 μL ddH2O，与第一步反应体系充分混匀，37℃反应15 min，85℃5 s，4℃保存备用。利用NanoDrop 2000分光光度计测定cDNA模板的浓度，稀释至200～300 ng·µL-1存于–20℃冰箱备用。

通过内参基因进行反转录cDNA模板的验证，20 μL PCR反应体系包括rTaq酶反应混合物10.0 μL，上下游引物（表1）各0.8 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 7.4 μL。反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环；72℃ 10 min，4℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

2 结果与分析

2.1 EgriCSP8在灰茶尺蠖不同发育时期的表达分析

前期研究发现，在茶尺蠖3龄幼虫期高表达[22]。为了明确其直系同源基因是否在灰茶尺蠖幼虫期大量表达，本研究收集了灰茶尺蠖不同发育时期，包括卵、幼虫期（3龄）、雌雄蛹期和雌雄成虫期，通过qRT-PCR分析在各发育时期的表达动态。结果表明，在灰茶尺蠖各个发育阶段都有表达，但相对表达丰度存在差异。在灰茶尺蠖卵期表达水平很低，在3龄幼虫期表达量最高，进入蛹期后雌雄两性的表达量均迅速下降，直至成虫期都维持相对较低的表达水平（图1）。表达量在3龄幼虫期与其他发育时期存在显著差异；卵、雌雄蛹期及雌雄成虫期之间差异不显著。

表1 实时荧光定量PCR引物

2.2 EgriCSP8在灰茶尺蠖幼虫不同组织的表达分布

解剖灰茶尺蠖3龄幼虫，利用qRT-PCR比较在灰茶尺蠖幼虫头部、中肠、表皮和脂肪体中的相对表达量。结果表明，主要表达于幼虫头部和表皮，其他部位的相对表达量很低，其中幼虫头部表达量较其他组织差异显著（图2）。

注：不同字母表示样品之间存在显著差异（P＜0.05），下同

图2 EgriCSP8在灰茶尺蠖3龄幼虫不同组织的表达

2.3 Eobl-EgriCSP8在茶尺蠖两近缘种间的表达分析

利用qRT-PCR比较分析了在茶尺蠖两近缘种3龄幼虫间的表达量，结果表明，在茶尺蠖与灰茶尺蠖间的表达量存在显著差异，在茶尺蠖3龄幼虫中的表达量显著高于其直系同源基因在灰茶尺蠖3龄幼虫中的表达（图3）。

2.4 Wolbachia对Eobl-EgriCSP8表达的影响

为分析共生菌是否与在茶尺蠖两近缘种间表达差异有关。本研究利用qRT-PCR比较分析了灰茶尺蠖3龄幼虫在去除前后表达量的变化。结果表明，的去除对的表达量存在显著影响，与未处理组相比，去除的灰茶尺蠖3龄幼虫中的表达量显著降低（图4）。

进一步分析比较在去除的灰茶尺蠖中表达量与在茶尺蠖3龄幼虫中的表达量发现，在茶尺蠖中的表达量显著高于在灰茶尺蠖突变体中的表达量（图5）。

图3 Eobl-EgriCSP8在茶尺蠖两近缘种3龄幼虫间的表达量

图4 EgriCSP8在灰茶尺蠖与灰茶尺蠖Wolbachia突变体3龄幼虫间的表达量

图5 EoblCSP8在茶尺蠖与其直系同源EgriCSP8在灰茶尺蠖Wolbachia突变体3龄幼虫间的表达量

2.5 顺-3-己烯-1-醇对Eobl-EgriCSP8表达的影响

由图6可知，茶尺蠖3龄幼虫在顺-3-己烯-1-醇诱导处理后，转录表达水平均略高于对照组，但统计分析表明诱导处理前后的表达均无显著差异。

灰茶尺蠖3龄幼虫在顺-3-己烯-1-醇诱导处理4 h和8 h时，转录表达水平没有显著变化，诱导12 h处理后表达量有所上升但差异不显著（图7）。

3 讨论

鳞翅目蛾类幼虫是害虫危害农作物主要虫期，研究幼虫中高表达的靶标功能基因有助于研发幼虫的绿色防控技术。本研究比较分析了化学感受蛋白基因在茶尺蠖两近缘种幼虫间的转录表达，有助于解析CSPs在调控茶尺蠖两近缘种识别定位茶树中的生理功能。

CSPs被报道表达于昆虫的化学感受器官，参与调控昆虫的化学通讯行为[27]。大螟（）被证实表达于雄蛾触角，并且强烈结合雌蛾合成释放的性信息素[28]。CSPs在半翅目盲蝽类昆虫中也被广泛研究，通过免疫组织定位研究发现苜蓿盲蝽的CSP1-6均可在成虫触角化学感器中表达，体外荧光竞争性结合试验证实CSP1-6可以结合大多数寄主植物挥发物[6,29]。本实验室前期研究鉴定了14个茶尺蠖化学感受蛋白基因，表达谱分析发现在茶尺蠖3龄幼虫期表达水平较高[22]。实验室前期研究发现灰茶尺蠖中存在的直系同源基因，明确的发育时期及组织表达分布，有助于分析其潜在的生理功能。

本研究首先利用qRT-PCR分析了在灰茶尺蠖不同发育时期的表达动态，结果表明，与其直系同源基因具有保守的发育表达模式，和都在茶尺蠖两近缘种幼虫期大量表达。组织表达谱分析发现，与相似，均表达于幼虫头部与表皮，统计分析结果显示在灰茶尺蠖幼虫头部表达量显著高于表皮和其他组织。鳞翅目蛾类幼虫头部是其主要的化学感受器官[30-32]。灰茶尺蠖幼虫头部感器结构研究表明，头部触角上着生有栓锥形感器、锥形感器、刺形感器，上下唇与上下颚等也分布有化学感器[33]。与在茶尺蠖两近缘种幼虫头部高表达暗示其可能涉及幼虫化学通讯行为，然而该推论还需进一步提供在茶尺蠖两近缘种幼虫头部化学感器表达的证据。此外，均可表达于茶尺蠖两近缘种3龄幼虫表皮，尤其是在茶尺蠖3龄幼虫表皮中表达量较高[22]，据此推测，在茶尺蠖与灰茶尺蠖两近缘种间可能还涉及调控其他生理过程。

图6 顺-3-己烯-1-醇诱导对EoblCSP8在茶尺蠖中表达的影响

图7 顺-3-己烯-1-醇诱导对EgriCSP8在灰茶尺蠖中表达的影响

昆虫CSPs可以被农药等外源性化合物诱导表达例如被证实在烟粉虱（）B生物型和Q生物型中的表达量不同，新烟碱类农药噻虫嗪诱导处理后的表达量提高了5～10倍[34]；阿维菌素处理家蚕也可以显著改变基因的转录表达[8]；体外表达的中华蜜蜂（）CSP1重组蛋白可以与新烟碱类农药吡虫啉发生互作[35]。本研究分析了茶树挥发物顺-3-己烯-1-醇对的诱导表达情况，结果显示，挥发物顺-3-己烯-1-醇诱导处理后，与的表达量在不同处理时间略有变化，但与相同时间下的对照组差异不显著。功能基因的诱导表达可能受处理时间、诱导底物、组织样品间的变异等多种因素影响，是否是诱导底物选择、处理剂量或样品间的变异等导致该结果仍然需要后续更为详细的研究分析。

CSPs在蛾类昆虫近缘种幼虫间的比较分析报道较少。本研究比较分析了在茶尺蠖两近缘种幼虫间的表达量，结果显示，在茶尺蠖3龄幼虫中的表达量显著高于在灰茶尺蠖3龄幼虫中的表达。进一步研究比较灰茶尺蠖与灰茶尺蠖突变体、茶尺蠖与灰茶尺蠖突变体间的表达量发现，共生菌的去除显著降低了在灰茶尺蠖3龄幼虫中的表达量，导致灰茶尺蠖突变体中的表达量显著低于茶尺蠖3龄幼虫。亚致死剂量吡虫啉处理褐飞虱可增加褐飞虱体内的，同时诱导提高了细胞色素P450基因的表达，当利用四环素清除后基因的诱导表达被明显减弱[36]。本研究中，在灰茶尺蠖中的去除同样显著降低了在灰茶尺蠖中的转录表达，证实共生菌可能参与调控昆虫化学感受相关基因在近缘种间的转录表达。

致谢：感谢中国农业科学院茶叶研究所孙晓玲研究员提供本研究中茶树挥发物顺-3-己烯-1-醇。

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The Expression Profiles of Chemosensory Protein 8 Orthologs in Two Closely Related Tea Geometrid Species,Prout andWarren

YAN Yuting1,2, LI Yujie2,3, WANG Qian4, TANG Meijun2, GUO Huawei2, LI Hongliang1*, SUN Liang2*

1.College of Life Science, China Jiliang University/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection and Quarantine, Hangzhou 310018, China; 2.Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3.Department of Plant Protection, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China; 4.College of Agriculture and Food Science, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, China

Chemosensory proteins (CSPs) play crucial roles in insect chemosensory and non-chemosensory processes.Prout and its sibling species,Warren are serious lepidopteran moth pests in tea gardens and they cause destructive damages to tea plants.The development of greener and environmentally friendly pest managements would benefit from orthologous CSPs’ investigation on the interaction between twospecies and tea plants.This study mainly examined the expression profiles of, the orthologs ofinby using the real-time quantitative PCR experiment.The qRT-PCR results show thatandhad a conserved larvae-enriched expression pattern.was mainly expressed in the heads of the third instar oflarvae.Next, the expression levels ofwere compared betweenand.The results show that the expression level ofinwas higher than that ofin.In addition, the effects ofand tea plant volatiles onexpression levels inandwere also estimated.The results show that theexpression level declined significantly whenwas removed in, which provided the first evidence that the insect CSPs’ expression is associated with.These findings laid a foundation for the future studies on the molecular mechanisms of chemosensory and coevolution between the geometrid sibling species and tea plants.

Prout,Warren, chemosensory protein,, expression analysis

S571.1，S435.711

A

1000-369X(2022)02-200-11

2021-03-19

2021-04-14

中国科协青年人才托举工程项目（2018QNRC001）、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610212020001，1610212018010)、国家自然科学基金（31501652，31871977）

严玉婷，女，硕士研究生，主要从事昆虫生化与分子生物学方面的研究。*通信作者：hlli@cjlu.edu.cn；liangsun@tricaas.com

（责任编辑：黄晨）