二醇型人参皂苷HPLC含量测定研究

2022-04-20林花王欣宇金龙哲刁春研安然武文琳车成来

农业与技术 2022年7期

林花王欣宇金龙哲刁春研安然武文琳车成来

(1.延边朝鲜族自治州农业科学院，吉林延吉 133000；2.吉林省汪清县农业技术推广中心,吉林汪清 133100)

人参(Panax ginseng G.A.Meyer)为五加科植物，味甘，微苦，性平和，是我国具有代表性的传统中药，有多年的中医临床应用历史，具有强大的治愈作用[1]。经研究表明，人参皂苷是人参主要的活性成分，其种类和含量是评价人参及其产品质量的重要指标。按照人参皂苷苷元的差别，将人参皂苷分成齐墩果酸型皂苷、原人参三醇型皂苷和原人参二醇型皂苷。二醇型人参皂苷含有多种人参皂苷，如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg、Re等，是人参的主要活性成分，具有抗肿瘤[2]、增强免疫[3]、调节神经系统[4]、改善心脑血管功能[5]、保护肝脏[6]、延缓衰[7]等功效。本研究采用高效液相色谱法测定人参二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd，为人参的质量控制提供可靠的依据。

1 试验材料

1.1 试验仪器

高效液相色谱仪(1260,安捷伦)，十万分之一电子天平(OHAUS)，超声波清洗机(KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司)，独立超纯水系统(OminiG，厦门锐思捷水纯化技术有限公司)，冷冻干燥机(Benchtop Pro 3L ES-55,SP Scientific),离心机(TG16-WS,湖南湘立科学仪器有限公司)，pH计(STARTER 2100，奥豪斯上海化学有限公司)。

1.2 试验试药

人参皂苷标准品Rb1、Rb2、Rc、Rd(成都德锐可生物科技有限公司)，氢氧化钙(天津市科密欧化学试剂有限公司，20160618)，甲醇(沈阳化学试剂场)，磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，20141009)，乙腈(沈阳化学试剂场)，乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。人参(长白山红参)。

2 试验方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

分别称取对照品Rb1、Rb2、Rc、Rd各2mg,分别加入甲醇2mL，得到1mg·mL-1的单标品溶液，用于人参皂苷的定性分析，确定各个单体的出峰时间。另分别称取人参皂苷对照品Rb1 2.16mg,Rb2 2.30mg,Rc 2.28mg,Rd 2.10mg,再分别加入2mL甲醇，制备成浓度为1.08mg·mL-1、1.15mg·mL-1、1.14mg·mL-1与1.05mg·mL-1的储备液，分别从4份储备液中提取0.25mL，混匀，即得混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

将人参切成1cm3的小块，再用刀片式粉碎机粉碎成粗粉，过40目筛，即得人参粗粉。蒸馏水用饱和石灰水调节成pH13的碱水，精密称取人参粉末5g，加入50mL碱水，搅拌均匀，利用超声清洗机在温度20℃，功率180W的条件下碱水超声提取30min，取出烧杯，将提取液用离心机进行离心5min转速为10000r·min-1，得到滤液进行冷冻干燥3d，取出干燥物，磨成粉末，得到粉末1.12g，取粉末500mg，加入50mL甲醇，超声溶解，即得10mg·mL-1的供试品溶液。

2.2 含量测定方法

2.2.1 高效液相色谱条件

色谱柱Hypersil Gold C18 (250mm×4.6μm,5μm),检测波长为203nm，进样量为10μL，柱温为40℃，流速为1.000mL·mL-1，梯度洗脱如表1所示。

表1 梯度洗脱

2.2.2 标准曲线的制备

取4种单标溶液，分别用移液枪吸取1mL放入4个进样小瓶，在2.2.1色谱条件下进行高效液相检测分析，每种皂苷都会出现其特征峰，记录出峰时间，用于人参皂苷的定性分析，可用来确定4种人参皂苷混合时的出峰顺序。另分别从Rb1、Rc、Rb2、Rd 4种储备液中各吸取100μL放入同一进样小瓶，各皂苷浓度均为0.25mg·mL-1。分别从4种储备液中吸取90μL，放入同一进样小瓶，再加入甲醇40μL配制成总体积为400μL，浓度为0.225mg·mL-1的混合对照品溶液。分别从4种储备液中吸取80μL放入同一进样小瓶，再加入甲醇80μL，配制成总体积为400μL，浓度为0.2mg·mL-1的混合对照品溶液。按此方法，配制出浓度梯度为0.175mg·mL-1、0.15mg·mL-1、0.125mg·mL-1和0.1mg·mL-1、0.075mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.025mg·mL-1的10组混合对照品溶液。将10个浓度梯度的进样小瓶用于高效液相检测，按照已经确定的出峰顺序来判断各个时间所出的峰为哪种人参皂苷，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

2.2.3 精密度试验

取2.1.1中制备的混合对照品溶液，在2.2.1的色谱条件下进行HPLC检测分析，每次进样10μL，连续进样5次，利用得到的混合标准品溶液中各个皂苷单体的峰面积计算RSD值。若RSD值均不大于2%，则仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验

精密吸取4种人参皂苷混合的供试品溶液，在0h、2h、4h、8h、12h分别进样10μL，在2.2.1的色谱条件下进行HPLC检测分析，根据所得到的混合样品中各个皂苷单体的峰面积，计算RSD值。如果RSD值不大于2%，则说明供试品溶液稳定性良好。

2.2.5 重复性试验

精密吸取4种人参皂苷混合的供试品溶液，平均分为5份，在2.2.1的色谱条件下进行HPLC检测分析，平行5次试验，根据所得到的混合样品中各个皂苷单体的峰面积，计算RSD值。如果RSD值小于3%，则表明重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验

取已被准确定量的混合对照品溶液：浓度分别为Rb1 0.102mg·mL-1、Rb2 0.128mg·mL-1、Rc 0.128mg·mL-1、Rd 0.111mg·mL-1，从中吸取1mL作为空白样品溶液。另取浓度为0.1mg·mL-1的单标溶液，分别将每种单标溶液取0.1mL放进空白溶液中。在2.2.1的色谱条件下进行HPIC检测分析，平行5次试验，根据所得到的各个皂苷单体的峰面积，利用标准曲线的线性回归方程计算各个皂苷单体的浓度，从而计算各个单体的加样回收率。

2.3 样品测定

将供试品溶液经0.45μm微孔滤膜抽滤后，精密吸取1mL，在2.2.1的色谱条件下，连续进样3次，每次进样会得到4种单体的峰面积，根据标准曲线回归方程，会计算出每种单体的浓度，继而可以计算出每种单体的含量，3次进样后每种单体会有3个含量，取平均值。

3 试验结果

3.1 人参皂苷的定性分析

取单标准品溶液，根据2.2.1的色谱条件进行4种人参皂苷标准品Rb1、Rb2、Rc、Rd的定性分析，确定其出峰时间，如图1～4所示。

图1 人参皂苷标准品Rb1色谱图

图2 人参皂苷标准品Rc色谱图

图3 人参皂苷标准品Rb2色谱图

图4 人参皂苷标准品Rd色谱图

结果显示，人参皂苷标准品Rb1、Rc、Rb2、Rd的出峰时间分别为16.000～17.000min、17.000～19.000min、20.000～22.000min、26.000～28.000min。

在2.2.1的液相色谱条件下，将4种人参皂苷标准品的混合标准品溶液进行HPLC检测分析，检测分析结果如图5所示。

图5 混合人参皂苷标准品Rb1,Rc,Rb2,Rd色谱图

根据结果显示，上述4种人参皂苷标准品的混合样品中，人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd的出峰时间范围分别在16.000～17.000min、17.000～19.000min、20.000～22.000min、26.000～28.000min的范围内，因此，混合标准品与各人参皂苷标准品单品所检测到的出峰时间具有良好的对应关系。从而确定该液相色谱条件能够很好地分离出4种人参皂苷。

3.2 人参皂苷的定量分析

3.2.1 标准曲线的制作

取按照浓度梯度稀释的混合对照品溶液，根据上述的色谱条件进行高效液相检测，根据已经得知的出峰时间和出峰顺序记录各个人参皂苷单体的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作的标准曲线如图6～9所示。

图6 人参皂苷Rb1的标准曲线

图7 人参皂苷Rc的标准曲线

图8 人参皂苷Rb2的标准曲线

以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到线性回归方程，Rb1：Y=3E+07X+140948，相关系数R2=0.9995；Rc：Y=3E+07X-165794,相关系数R2=0.9995；Rb2：Y=2E+07X+55853,相关系数R2=0.9995；Rd：Y=3E+07X-155679,相关系数R2=0.9998。根据结果得知4种人参皂苷有良好的线性关系。

3.2.2 精密度试验

通过2.2.3的试验方法，所得到的峰面积如表2所示。