郭 健，任维超，李保华

（青岛农业大学植物医学学院，山东 266109）

由苹果黑星病菌（Venturia inaequalis(Cooke)Wint.）引起的苹果黑星病又称苹果疮痂病、苹果黑点病，在世界各苹果产区均有发生[1-2]。苹果黑星病主要危害叶片和果实，也可侵染叶柄、花、萼片、花梗、嫩枝和芽鳞等多个部位，导致早期落叶，果实疮痂、畸形，影响苹果的产量、品质及其商品价值，严重的年份经济损失超过70%[1-3]。苹果黑星病菌主要以未成熟的假囊壳在落地的病叶上越冬[4-6]，也以菌丝体或分生孢子在芽鳞内越冬[7]。翌年花期前后，产生子囊孢子和分生孢子侵染幼嫩组织，初侵染病斑显症后，产生大量分生孢子，随雨水传播再侵染。4—6 月雨水较多，6 月底可造成严重危害。

苹果黑星病在我国属于区域性的检疫病害[8-9]。近年来，部分苹果产区发生严重，并且有向其他种植区扩展蔓延的趋势[3,10-13]。清除果园地面上的越冬病叶，春季喷施化学药剂是目前防治苹果黑星病的主要技术措施[11-12,14]。然而，在实际生产中发现，用于防治苹果黑星病的高效药剂氟硅唑对苹果早期生长有抑制作用，而苯醚甲环唑等药剂的防治效果又不理想。为了筛选防治苹果黑星病的高效药剂，控制苹果黑星病的扩展蔓延，本研究测试了9 种杀菌剂对苹果黑星病的防治效果，旨在为苹果黑星病的防治提供高效药剂和适宜的施药时期。

1 材料与方法

1.1 供试病菌

2019 年10 月从病区采集感染苹果黑星病的病叶，阴干，保存于-18 ℃冰箱。2020 年4 月，取保存的苹果黑星病叶，用纯净水将病叶上的分生孢子洗下，配制成1.0×104个/L 孢子的孢子悬浮液，加入0.1%的吐温20，喷雾接种嘎拉苹果的新梢，接种后套塑料袋保湿24 h。30 d 后待接种叶片充分发病并产孢后，取病叶上的新鲜孢子，配制成1.0×106个/L 的孢子悬浮液用于室内药剂毒力测定，1.0×104个/L 的孢子悬浮液用于田间药效试验。孢子悬浮液随配随用，放置时间不超过30 min。

1.2 供试药剂

根据相关的研究报道，结合应用成本、国内生产能力等因素，选择了9 种杀菌剂作为供试药剂，其中3 种属于琥珀酸脱氢酶抑制剂（表1）。测试药剂若为原药，则用甲醇配制成1.0×104mg/L 的母液，用于室内毒力测定。测试药剂若为制剂，则直接用灭菌的蒸馏水稀释成相应剂量，用于室内毒力测定和室外药效试验。

表1 苹果黑星病毒力测定和药效试验所使用的药剂的名称、剂型、剂量和生产厂家

1.3 药剂室内毒力测定

不同药剂对苹果黑星病菌分生孢子萌发的抑制效果采用孢子萌发法测定[15-17]。根据预备试验确定的剂量，参考生长速率抑制法，将供试药剂加入到2%的水琼脂中，混匀后配成系列浓度的含药水琼脂平板，以不加药剂的水琼脂平板为对照。用移液枪取300 μL 孢子悬浮液，滴加到水琼脂平板上，涂布均匀，待水分晾干，转于25 ℃的恒温培养箱中，培养24 h 后取出，在100 倍显微镜下检查孢子的萌发率。每种药剂5 个浓度，每个浓度5 个平板，每个平板随机检查5 个有10～30 个孢子的视野，记录萌发孢子数和未萌发孢子数。当孢子芽管长度超过孢子纵径的一半时，记为萌发。全部试验独立重复3 次。

以对照组的孢子的平均萌发率校正萌发孢子数和未萌发孢子数，将剂量转换为剂量对数。以剂量对数为自变量，以校正的未萌发孢子数和相应的萌发孢子数为因变量，拟合广义线性模型（GLM），GLM 模型中的family 参数选择二项分布（Binomial）。依据拟合模型，计算EC50和置信区间。数据分析在R（Ver.3.6.0）中完成。

1.4 杀菌剂的保护效果

在室外通过先施药后接种的方法[18-20]，测试了9种杀菌剂保护叶片阻止苹果黑星病菌分生孢子侵染的效果。每种药剂设置2 个接种时间，即施药后第1 d 和第5 d 接种，以清水为对照，共计20 个处理。每个处理接种1 个苹果新梢，每个新梢保证有5 片完全展开的幼嫩叶片。试验时，从3～4 株3 年生的盆栽富士苹果树上选取20 个新梢作为1 次重复，全部试验在不同的苹果树上重复3 次。

2020 年7 月下旬苹果二次梢生长期，从11 株树上选择并标记60 个具有5 片完整幼嫩叶片的二次新梢，将药液喷施到标记新梢上，直到药液流下为止。为了防止药剂交叉污染，喷药时用塑料桶遮住喷雾器和处理梢。分别于喷药后（施药当天为第0 d）的第1 d 和第5 d，选择傍晚或阴雨天，用手持小喷壶将黑星病菌的分生孢子悬浮液喷雾接种到相应的新梢上，直到接种叶片上有孢子悬浮液流下为止。接种后，用塑料袋包严整个接种梢，保湿24 h。为了避免病菌的交叉感染，接种时也用塑料桶遮住小喷壶和处理梢。

待接种叶片充分发病后，调查记录每个叶片上的病斑数。为了促进潜育病菌充分显症，将所有接种梢同5 个接种叶片全部剪下，置于保湿箱内，在20 ℃恒温箱内保湿培养24 h，待潜育病斑充分显症后，再次检查每个接种叶片正面和背面的病斑数。将保湿处理后每个接种梢上5 片叶片的病斑数累加，用于统计分析。

以药剂为处理因子，每个重复所有叶片上的总病斑数为效应因子，拟合广义线性模型（GLM）。GLM 模型中，family 参数选择泊松分布（Poisson）。通过分析嵌套模型的变异度分析，比较了9 种杀菌剂对黑星病斑的保护效果。2 次接种数据分别分析。

1.5 杀菌剂的内吸治疗效果

在室外通过先接种后施药的方法[18-20]，测试9种内吸性杀菌剂对苹果黑星病的治疗效果。药剂于病菌接种后（接种当天记为第0 d）第4 d 喷施药，以清水为对照，共计10 个处理，每个处理接种1个苹果新梢，每个新梢保证有5 片完全展开的幼嫩叶片。试验时，从2～3 株3 年生的盆栽富士苹果树上选择10 个新梢作为1 次重复。全部试验在不同的苹果树上重复3 次。

2020 年7 月下旬苹果二次新梢生长期，在8 株树上选择并标记30 个具有5 片完整幼嫩叶片的二次新梢，于傍晚或阴雨天，用手持小喷壶将黑星病菌的分生孢子悬浮液喷雾接种到标记的新梢上，直到接种叶片上有孢子悬浮液流下为止。接种后，用塑料袋包严整个接种梢，保湿24 h。接种后第4 d，将药液喷施到相应的接种梢上，直到药液流下为止。为了防止药剂交叉污染，喷药时用塑料桶遮住喷雾器和处理梢。病斑的检查方法和药剂内吸治疗效果的分析方法同药剂保护效果试验。

2 结果与分析

2.1 9 种杀菌剂对苹果黑星病菌的室内毒力

在25 ℃下培养24 h 后，苹果黑星病菌分生孢子在2%的水琼脂平板上萌发率在53%～64%之间，平均为57.3%；在含药的水琼脂平板上，孢子萌发率在1%～56%之间，校正萌发率在2%～97%之间。所测试9 种杀菌剂中，氟啶胺对苹果黑星病分生孢子萌发的抑制效果最好，EC50为0.003 0 mg/L；其次为氟唑菌酰羟胺，EC50为0.004 6 mg/L；克菌丹和咪鲜胺对黑星病菌分生孢子萌发的抑制中浓度较高，EC50分别为4.940 0 和4.540 0 mg/L；3 种琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂、吡唑醚菌酯对苹果黑星病菌分生孢子的萌发抑制中浓度较低，EC50都小于0.01 mg/L（表2）。

表2 9 种杀菌剂对苹果黑星病分生孢子萌发的抑制毒力

2.2 杀菌剂对苹果黑星病的保护效果

药剂保护效果试验中，2 批叶片于接种后第20 d 开始陆续发病，第46 d，平均每片接种叶片上的病斑数为2.2 个，单片叶片病斑数最多为32 个。在25 ℃下保湿24 h 后，每片接种叶片上的平均病斑数增加至2.5 个，单片叶片最大病斑数增加至38 个。在施药1 d 后接种的叶片上，9 种药剂处理叶片上的病斑数显著低于对照，对照每个梢上的总病斑数平均值为54.67 个，表明9 种药剂都能有效保护苹果叶片，抑制苹果黑星病菌的侵染。其中，氟唑菌酰羟胺、克菌丹、吡唑醚菌酯、嘧霉胺、吡噻菌胺和苯醚甲环唑6 种药剂的保护效果较好，用药后第1 d 的保护效果都在90%以上。施药后第5 d 接种的叶片上，9 种药剂处理叶片上的病斑数显著低于对照，对照每个梢上的总病斑数平均值为60.33 个，表明9 种测试药剂在施药后第5 d 都能有效抑制苹果黑星病菌的侵染。其中，氟唑菌酰羟胺、克菌丹和吡噻菌胺的保护效果较好，喷药后第5 d 的保护效果仍在90%以上（表3）。

表3 不同时间喷施9 种药剂抑制苹果黑星病菌侵染的效果

2.3 杀菌剂对苹果黑星病的内吸治疗效果

在药剂治疗效果试验中，用苹果黑星病菌分生孢子喷雾接种18 d 后苹果叶片开始发病。接种25 d后叶片上的平均病斑数达5.62 个，单片叶片上病斑数最多达54 个。在25 ℃下保湿24 h 后，每片叶片上的平均病斑数增加至9.35 个，单片叶片的最大病斑数增加至68 个。

从表4 可以看出，病原菌接种后第4 d 喷药，氟唑菌酰羟胺、嘧霉胺、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑4 种药剂处理5 片叶片上的总病斑数分别为2.00、12.33、22.33、23.67 个，显著低于对照，对照每个梢上的总病斑数平均值为154.00 个。表明这4 种药剂在接种后第4 d 施药能有效抑制已侵染的黑星病菌扩展形成病斑，其中，氟唑菌酰羟胺的内吸治疗效果最好，达98.7%。

表4 病菌接种后第4 d 喷施9 种杀菌剂对苹果黑星病的内吸治疗效果

3 讨论与结论

测试的9 种杀菌剂按厂家推荐剂量使用时，都能较好地保护苹果叶片阻止苹果黑星病菌分生孢子的侵染，在施药后的第5 d 保护效果在70%以上。所有测试药剂都可以在病菌侵染前作为保护性杀菌剂使用，有效保护叶片和果实，避免其受到苹果黑星病菌的侵染。其中，20%氟唑菌酰羟胺悬浮剂、80%克菌丹水分散粒剂和20%吡噻菌胺悬浮剂3 种药剂的保护效果较好，用药第5 d 保护效果仍达90%。然而，在所测试的9 种药剂中，只有20%氟唑菌酰羟胺悬浮剂、40%嘧霉胺悬浮剂、25%吡唑醚菌酯乳油和10%苯醚甲环唑水分散粒剂4 种药剂在病菌侵染后的第4 d 喷施，能有效抑制病菌扩展形成病斑。因此，在9 种测试药剂中，氟唑菌酰羟胺、嘧霉胺、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑4 种药剂可作为防治苹果黑星病的防治药剂，在苹果黑星病菌侵染前或侵染后的5 d 内使用，可获得良好的防治效果；克菌丹和吡噻菌胺可作为防治苹果黑星病的保护剂使用，建议在苹果黑星病菌侵染前的5 d 内使用，可获得良好的防治效果。

在所测试的9 种药剂中，不同药剂对苹果黑星病菌分生孢子萌发的抑制中浓度差异较大。其中，3 种琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂对苹果黑星病菌分生孢子的萌发抑制中浓度较低，除氟唑菌酰羟胺，氟啶胺和吡噻菌胺的加工制剂在活体叶片上的防治效果与其室内毒力相比相差甚远，没有表现出其应有的抑菌毒力，其原因尚不明确。加工剂型不能充分发挥其应有毒力可能是重要原因。吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑是近年来防治苹果黑星病的推荐药剂。本试验测试结果也表明，吡唑醚菌酯对苹果黑星病仍有较好的防治效果，苯醚甲环唑防治效果虽不理想，但仍然有效，2 种药剂仍可作为防治苹果黑星病的药剂，应与其他药剂交替使用。嘧霉胺是防治灰霉病的主要药剂。本试验表明，嘧霉胺对苹果黑星病有较好的内吸治疗效果，其效果好于吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑，可在春季作为内吸治疗剂使用。克菌丹和吡噻菌胺对苹果黑星病的保护效果很好，但没有内吸治疗效果，可在降雨前作保护剂使用。2021 年，在黑星病的田间防治试验中发现，氟吡菌酰胺与肟菌酯的混配制剂、氯氟醚菌酯与吡唑醚菌酯的混配制剂和氟吡菌酰胺与戊唑醇的混配制剂对苹果黑星病也有较好的防治效果，其效果优于苯醚甲环唑，但不及嘧霉胺（未发表数据）。氟硅唑曾是防治苹果黑星病的特效药剂，然而国内的应用发现，氟硅唑对苹果幼果和新梢的生长有一定的抑制作用，不宜在苹果幼果期或生长前期使用，但可以作为雨季防治苹果黑星病的主要药剂，用药次数不能超过3 次。

4—6 月是苹果黑星病的防治关键时期[5,21]。苹果黑星病菌能以未成熟的假囊壳在落叶上越冬，或以菌丝在芽内越冬。苹果开花前后，越冬病菌产生子囊孢子和分生孢子，遇雨后释放，并随雨水和气流传播侵染苹果幼嫩组织。对于苹果黑星病的防治，应于苹果展叶后开花前结合苹果锈病和苹果白粉病的防治喷施内吸治疗性杀菌剂，如苯醚甲环唑等，防止在芽内越冬的病菌扩展产孢，并保护幼嫩组织不受病菌侵染。苹果谢花后，结合苹果霉心病、苹果锈病和苹果白粉病的防治，喷施广谱高效的保护性杀菌剂，如克菌丹、吡噻菌胺等，保护苹果幼嫩组织，减少黑星病菌的侵染；若用药前遇雨量超过10 mm 使叶果结露超过12 h 的降雨，需改喷内吸治疗性杀菌剂，如嘧霉胺、吡唑醚菌酯等。春季多雨年份，谢花后至幼果套袋应结合其他病害的防治喷施1～2 次高效的内吸治疗性杀菌剂，如氟唑菌酰羟胺、嘧霉胺等。多雨年份，6 月进入雨季后，应结合叶部、果实和枝干病害的防控，喷施1～2次对苹果黑星病有内吸治疗效果的杀菌剂，如氟硅唑、氟唑菌酰羟胺等。