张艳杰，王金慧，刘胜男，潘治利，李 真，范会平，艾志录

（1. 河南农业大学食品科学技术学院，郑州 450002；2. 农业农村部大宗粮食加工重点实验室，郑州 450002；3. 河南省冷链食品工程技术研究中心，郑州 450002）

0 引 言

饺子作为中国典型的传统美食，因其特殊的历史意义而备受消费者喜爱，随着食品工业机械化、自动化的发展，速冻饺子逐步取代繁琐的手工水饺，在国内市场上占据着重要地位。目前速冻饺子面临的煮后混汤、破损率高、感官品质变差等问题，严重制约了其发展。出现这一现象的主要原因是因为在冻藏过程中冰晶的重结晶作用会弱化面筋网络结构。目前，研究多是从改善饺子粉原料或是在加工过程中添加改良剂的方式来改善饺子品质。

抗冻蛋白（Antifreeze Proteins，AFPs）是一类能够抑制冰晶生长，能以非依数形式降低水溶液冰点，但不影响其熔点的特殊蛋白质。燕麦抗冻蛋白（Oat (L.) Antifreeze Proteins，AsAFPs）是燕麦籽粒在冷诱导后，通过粗提取、硫酸铵沉淀阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱等步骤得到了一种具有抗冻活性的蛋白，纯AsAFPs的热滞活性较其他植物源抗冻蛋白高，热滞活性为1.24 ℃。AsAFPs中含有大量的无规则结构，约有35.5%的表面氨基酸残基暴露，使其具有高亲水性。目前研究中，AsAFPs已经在冷冻面团和冰淇淋中得到应用。AsAFPs可以提高冰淇淋的抗结冰性和抗熔融性，使得冰淇淋的玻璃化转变温度从-29.14 ℃提高到-27.74 ℃。AsAFPs可以降低冷冻面团水分流动性，提高酵母菌存活率，将冷冻面团制作成馒头后，其质地更柔软，黏聚性和回弹性更高。抗冻蛋白能够改变冰晶的生长方式、修饰冰晶形态、抑制重结晶。抗冻蛋白从来源上主要可分为鱼类、昆虫、细菌真菌及植物等，以植物源抗冻蛋白更适合运用到面制品中。非发酵面团也是面制品中的一个重要分支，但目前抗冻蛋白多运用在发酵冷冻面制品中。因此，研究抗冻蛋白在非发酵面团中的应用以及对冷藏下其品质变化也是十分必要的。

AsAFPs是植物源抗冻蛋白的一种，其天然的来源，较其他来源的添加剂具有优势，在冷冻食品的加工、储藏等过程中抑制冰晶重结晶的能力更为突出，对改善冷冻面制品的品质具有重要作用。因此，研究植物源抗冻蛋白在冷冻面制品中的作用及规律是必要的。本试验从经过冷诱导处理的燕麦籽粒中提取抗冻蛋白，将其添加到饺子皮中进行不同时间的冻藏处理，通过测定饺子皮含水率、可冻结水含量、色泽、质构、流变变化规律以及面筋蛋白游离巯基、二硫键、二级结构等，为探究AsAFPs在冷冻面制品中的作用机制和其在速冻行业的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

燕麦籽粒（含质量分数为20%的蛋白质，11%脂肪和22%碳水化合物），张家口海飞粮油有限公司；金苑特一粉（含质量分数为17%蛋白质，2%脂肪和25%碳水化合物），河南金苑粮油有限公司；盐酸胍、-巯基乙醇、硫酸铵、甘氨酸、脲、三氯乙酸、NaHPO、NaHPO、三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）、HCl、5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（5,5'-Dithiobis- (2-nitrobenzoic acid)，DTNB）等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

JJ-1型增力电动搅拌机，常州翔天实验仪器厂；PHS-3C 型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；5430R型高速冷冻离心机，艾本德（上海）国际贸易有限公司；BTP.8XL.0型冷冻干燥机，美国SP科学公司；DHR-2型流变仪，沃特斯科技（上海）有限公司；DSC-214型差示扫描量热仪，德国耐驰公司；TA-XT型质构仪，英国Stable microsystem公司；TenSorⅡ型傅里叶红外光谱仪，北京普析通用仪器有限责任公司；JV2000型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；DigiEye E0型电子眼，上海韵鼎公司。

1.3 试验方法

参考Zhang等的方法，从燕麦籽粒中提取AsAFPs。挑选健康、完整的燕麦籽粒，置于-18℃的环境中进行至少4周的冷诱导。冷诱导后的燕麦籽粒浸泡在3倍体积预冷的磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline，PBS）（50 mmol/L，pH值7.4）中，电动搅拌器搅拌8 h，将燕麦籽粒和PBS提取液固液分离。PBS提取物在4 ℃，10 000 r/min条件下离心30 min。收集上清液，用50%～100%饱和度的硫酸铵沉淀上清液，盐析液在上述同样的条件下进行离心，取出沉淀，透析液选用PBS（5 mmol/L，pH值7.4）用截留分子量为1 000的透析膜进行透析至无SO检出，冷冻干燥，即为AsAFPs粗蛋白。以燕麦籽粒中总蛋白质含量为基数，AsAFPs粗蛋白的得率约为0.5%。经验证AsAFPs粗蛋白在保留时间为-3.88 ℃时的热滞活性为2.07 ℃。

准确称取200 g小麦粉，加入80 g蒸馏水，和面机和面时间10 min，将和好的面团放入压面机，复合压延6次后放入保鲜袋密封，室温下静置20 min后，继续压延3次，最终将面带的厚度控制在（2.00±0.05） mm，切成7 cm×3 cm的长方形面片，用气密性良好的保鲜膜包裹，作为对照组，通过预试验，确定按小麦粉质量的0.5%添加AsAFPs，作为AsAFPs组。

通过预试验得到将制备好的饺子皮放入超低温速冻箱中在-40 ℃下测定中心温度，冻藏30 min时，中心温度下降至-18 ℃。采用此方法冻藏饺子皮30 min后，迅速放入-18 ℃冰箱冻藏。按照不同的冻藏时间（0、7、14、21、28 d）制作样品，用于进一步测定分析。

将铝盒置于105 ℃烘箱中烘至恒质量，其质量记为（g），取3 g左右饺子皮，置于室温下解冻30 min，将其放入铝盒中，记录其质量（g），在105 ℃烘箱中烘至恒质量，记录其质量为（g）。

采用电子眼进行测定，采用CIE-L a b色空间表示方法，代表亮度，代表红-绿值，代表黄-蓝值。值越大，表明饺子皮亮度越高。将不同冻藏时间的饺子皮解冻30 min后测饺子皮色度。

采用质构仪对不同冻藏时间的速冻饺子皮进行质构特性（Texture Profile Analysis，TPA）测试。取若干片冻藏一定时间的饺子皮放入500 mL沸腾的蒸馏水中煮3 min后于25 ℃的蒸馏水中静置30 s，捞出后将饺子皮水平放在载物台上，调整至质构仪探头正下方，保证面片表面光滑平整与载物台的接触面无气泡出现，然后进行质构指标的测定。

测试条件设置如下：探头P50；触发力为0.2N；测试压缩比例为20%；测前速率为2 mm/s；测试速率为1 mm/s，测后速率为5 mm/s；停留时间为1 s。

将冻藏一定时间的面片按1.3.5的方法煮制后用流变仪测定其流变学特性。

选择40 mm平板，夹具间隙1.2 mm。取待测饺子皮置于底部平板，降下顶部平板后，刮去平板以外多余面皮测试。

参数设置：应变恒定为0.05%，频率由0.1增大至100 rad/s，测定温度恒定为25 ℃。

采用差示扫描量热仪（Differential Scanning Calorimetry，DSC）对冻藏不同时间的速冻饺子皮的可冻结水进行测定。用剃刀取约10 mg冻藏不同时间的速冻饺子皮中心部位样品并称量，密封于小坩埚中，放置于DSC样品池中，以一个空坩埚作为参比。温度程序为在-30 ℃平衡5 min，然后以5 ℃/min升温至15 ℃。记录扫描曲线。通过热分析软件TA Universal Analysis获得速冻饺子皮的冰晶熔化焓。样品可冻结水含量（F）的计算公式如下

式中∆H为样品的熔化焓，J；∆H=333.3 J/g；为样品质量，g；W为样品含水率，g/g。

从制作好的饺子皮中提取面筋蛋白，将一部分提取好的湿面筋蛋白平均装入10个自封袋中，放入-40 ℃冰箱中速冻30 min，在进行不同时间的冻藏处理后冻干。巯基、二硫键的测定参考邢仕敏的方法。

取75 mg样品用1 mLTrls-Gly缓冲液混匀后加4.7 g盐酸胍，并定容至10 mL。

测定游离巯基时，取l mL样品溶液，加入4 mL脲-盐酸胍溶液和50LEllman's试剂，显色5 min后，于412 nm处测定吸光值。

测定二硫键时取1 mL样品溶液，加50L-巯基乙醇和4 mL脲-盐酸胍溶液于25 ℃保温60 min，然后加入10 mL 12%三氯乙酸（Trichloroacetic Acid，TCA）溶液，继续于25 ℃恒温60 min，4 200 r/min离心10 min用5 mL 12% TCA溶液清洗沉淀物二次，将沉淀物溶于10 mL 8 mol/L脲中，加40L Ellman's试剂，显色15 min后，测取412 nm处的吸光值。

巯基（SH）的计算公式如下：

式中为412nm吸光值；为样品浓度，mg / mL；为稀释因子，巯基取5.02，总巯基（巯基＋还原二硫键）取10。

二硫键（SS）的计算公式如下：

式中为还原前的巯基数；为还原后的巯基数。

采用傅里叶红外光谱法（Fourier Tansform Infrared Spectroscopy，FTIR）对1.3.8节中处理的面筋蛋白二级结构进行测定。在红外灯保护下，称取适量蛋白样品于玛瑙坩埚中，压片测定，光谱范围：400～4 000 cm，分辨率：4 cm，扫描次数：32次，用空气作为空白进行测定扣除背景。利用Origin软件对酰胺I吸收峰（1 600～1 700 cm）进行基线校正与高斯去卷积技术处理和二阶求导后进行曲线拟合，分析得出各二级结构分布图。

1.4 数据处理

所有数据均重复3次以上，以平均值±标准差的形式表示，数据间的差异显著性采用单因素方差分析（ANOVA）方法（SPSS16.0软件）进行分析，以<0.05表示数据间存在统计学上的差异，采用Origin2019软件制图。

2 结果与分析

2.1 AsAFPs对速冻饺子皮水分变化的影响

水分是影响速冻饺子品质最直接的因素之一。冻藏过程中饺子皮会发生干耗，冰晶升华，使得饺子皮内部水分流失，表皮干燥，导致速冻饺子皮煮后感官品质变差。含水率作为衡量速冻饺子皮品质的一个重要指标，冻藏过程中，饺子皮含水率的变化，很大程度上反映了饺子皮品质的波动情况。添加AsAFPs速冻饺子皮在不同冻藏时间下的含水率如图1所示。

图1 不同冻藏时间AsAFPs对速冻饺子皮含水率的影响 Fig.1 Effect of oat antifreeze protein on moisture content of quick-frozen dumpling wrapper under different frozen time

由图1可知，饺子皮经过28 d的冻藏，对照组含水率从34.98%下降至26.57%，AsAFPs组含水率从33.22%下降到29.34%。冻藏初期，添加AsAFPs的速冻饺子皮含水率较对照组样品略低，主要是AsAFPs和水分结合，束缚了部分水分，使水分蒸发受阻。随着冻藏时间的增加，两组样品之间的含水率差值逐渐减小。在冻藏时间到达14 d后，饺子皮开始出现明显的水分流失，添加抗冻蛋白的饺子皮含水率较对照组变化慢。出现这种情况的原因可能是：初始阶段加入饺子皮中的抗冻蛋白具有较强的吸水性，周围吸附了一部分水，将其束缚住，使得AsAFPs组饺子皮含水率较对照组低。冻藏过程中饺子皮内部水分冻结成冰晶，对细胞造成机械损伤，降低了饺子皮中各组分的持水能力，干耗现象严重，从而使得饺子皮水分损失加剧。而AsAFPs的加入可以抑制重结晶的作用，减少冻藏对饺子皮面筋网络结构的机械损伤，进而降低速冻饺子皮的水分损失，因而在冻藏后期，添加抗冻蛋白的饺子皮含水率较对照组高。

在整个冻藏过程中，速冻饺子皮处于持续性失水状态，冻藏开始时，两组样品水分损失无明显区别，均维持在较低水平。当冻藏时间达到14 d时，两组样品水分损失较为明显，21 d时，加入AsAFPs的饺子皮的失水率明显较对照组小（<0.05）。由此可以说明，向饺子皮中加入适量的AsAFPs可以增强其持水性，减少速冻饺子皮在冻藏过程中的水分损失。

冻藏过程中，饺子皮内的水可分为可冻结水和不可冻结水，其中可冻结水含量与冰晶形成数量呈正相关，是决定速冻饺子皮品质的重要指标。添加AsAFPs速冻饺子皮在不同冻藏时间下的可冻结水含量见图2。

由图2可知，在整个冻藏过程中，对照组样品的可冻结水含量始终高于AsAFPs组，并均随冻藏时间的增加逐渐增多，当冻藏时间到达14 d时，对照组饺子皮可冻结水含量较AsAFPs组显著增加（<0.05），到达冻藏末期28 d时，两组饺子皮可冻结水含量差值呈现出减少的趋势。这是由于冰晶生长导致面筋蛋白网络结构的破坏，蛋白质持水性降低，饺子皮内部水分的流动性增大，水分分布发生新的变化，可冻结水含量增多。AsAFPs的加入能够吸附部分自由水，加强蛋白网络结构，阻止饺子皮中水分的迁移，从而使得AsAFPs组饺子皮中可冻结水含量低于对照组。因此，AsAFPs的加入在一定程度上能够缓解冰晶在冻藏过程中对细胞造成的机械损伤，降低对蛋白网络结构的破坏，避免可冻结水含量大幅度增加，从而确保速冻饺子皮品质的稳定性。

图2 不同冻藏时间AsAFPs对速冻饺子皮可冻结水含量的影响 Fig.2 Effect of oat antifreeze protein on freezing water content of quick-frozen dumpling wrapper under different frozen time

2.2 AsAFPs对速冻饺子皮色泽的影响

色泽是评判速冻饺子皮品质的最直观因素，很大程度上影响着消费者的购买欲。对冻藏不同时间的饺子皮在解冻30 min后对其色泽进行测定，测定结果见表1。

表1 不同冻藏时间AsAFPs对速冻饺子皮色泽的影响 Table 1 Effect of oat antifreeze protein on colour of quick-frozen dumpling wrapper under different frozen time

由表1可知，冻藏时间对饺子皮的亮度、红绿度、黄蓝度均有显著影响（<0.05），其中对饺子皮亮度的影响是最为显著的。对照组和AsAFPs组饺子皮的亮度均呈现下降的趋势，主要可能是在冻藏过程中脂肪发生了一定程度的氧化造成的。但是AsAFPs组的亮度较对照组更暗些，这是由于AsAFPs本身具有的颜色会影响到饺子皮色泽，加入AsAFPs后使得饺子粉中蛋白质含量增加，也会导致亮度的降低。随着冻藏时间的延长，对照组和AsAFPs组的红绿度逐渐上升，黄蓝度逐渐下降。因此，单凭试验结果无法说明AsAFPs具有改善速冻饺子皮色泽，减少褐变的作用，但在一定程度上可以证明其能够稳定饺子皮色泽的变化。

2.3 AsAFPs对速冻饺子皮质构特性的影响

陶春生等的研究指出，速冻饺子皮的质地品质和感官评分可以通过质构特性来反映。AsAFPs对速冻饺子皮质构特性的影响见表2。

表2 不同冻藏时间AsAFPs对速冻饺子皮质构特性的影响 Table 2 Effect of oat antifreeze protein on texture properties of quick-frozen dumpling wrapper under different frozen time

由表2可知，新鲜饺子皮，对照组和AsAFPs组的饺子皮的硬度无显著差异。随着冻藏时间的延长，对照组和AsAFPs组冷冻饺子皮的硬度均呈现增加趋势。而在相同的冻藏时间下，添加AsAFPs的饺子皮硬度较对照组显著降低（<0.05）。这可能是因为AsAFPs组饺子皮的可冻结水含量较低，直接影响了冻藏过程中饺子皮冰晶形成量，使得添加AsAFPs的饺子皮形成的冰晶较少，使其饺子皮更加柔软，制品硬度较小。这和上述测得的可冻结水含量研究结果一致。

随着冻藏时间的延长，饺子皮的弹性、黏聚性、回复性整体呈现下降趋势，胶着性和咀嚼性呈现上升趋势。在相同的冻藏时间下，两组饺子皮之间的黏聚性和回复性差异不大；弹性、胶着性、咀嚼性存在明显的差异（<0.05），AsAFPs组饺子皮的弹性和咀嚼性比对照组显著增加（<0.05），胶着性明显降低（<0.05）。原因可能是在冻藏过程中，冰晶造成了饺子皮中网络结构的破坏，添加AsAFPs可降低可冻结水含量和抑制重结晶，减少了冰晶对网络结构的破坏，因此在一定程度上提高了饺子皮的弹性和咀嚼性。

2.4 AsAFPs对速冻饺子皮流变学特性的影响

流变学特性是评价饺子皮加工性能和感官品质的重要指标。储能模量（）表征弹性大小，是速冻饺子皮发生一定的形变所储存的能量；损耗模量()可用来表征黏性的大小，是饺子皮发生形变时所耗费的能量，不同冻藏时间处理下AsAFPs对速冻饺子皮储能模量和损耗模量的影响见图3。

图3 不同冻藏时间AsAFPs对速冻饺子皮储能模量和损耗模量的影响 Fig.3 Effect of oat antifreeze protein on elastic modulus and viscous modulus of quick-frozen dumpling wrapper under different frozen time

不同冻藏时间饺子皮的频率扫描图谱如图3所示。由图3a可知，在相同的频率下，随着冻藏时间的延长，AsAFPs组和对照组速冻饺子皮在同一频率下的储能模量逐渐下降，主要原因是因为速冻饺子皮在低温下水分冻结，随着冻藏时间的延长，冰晶使得饺子皮中的面筋网络结构发生更多的断裂，进而面团的弹性逐渐降低。同时，在相同的冻藏时间和扫描频率下，AsAFPs组的饺子皮样品的均高于对照组，另在扫描频率相同下，随着冻藏时间的延长，AsAFPs组的饺子皮的′的下降幅度显著小于对照组（<0.05），这说明在速冻饺子皮中添加AsAFPs可以降低冰晶对面筋蛋白结构的破坏程度，弱化面筋的交联作用。

图3b显示饺子皮在不同冻藏时间下，AsAFPs对样品损耗模量的影响。从图中可以看出AsAFPs组和对照组的均是随着冻藏时间的不断延长，而呈现下降趋势，原因主要是饺子皮在冻藏过程中冰晶的重结晶现象会不断严重，面筋蛋白受到了更大的机械损伤，使得饺子皮更容易发生形变。在相同的冻藏时间和频率下，AsAFPs组的显著高于对照组（<0.05），说明了AsAFPs可通过抑制饺子皮中的冰晶在冻藏过程中发生重结晶来降低冰晶对饺子皮面筋网络结构的破坏，增大饺子皮发生形变时的耗能。

2.5 AsAFPs对速冻饺子皮面筋蛋白的影响

二硫键含量作为蛋白质基质稳定性的一个重要反映，可间接反映冻藏过程中速冻饺子皮品质的稳定性。由图4可知，随着冻藏时间的延长，在经过28 d的冻藏，两组面筋蛋白样品的游离巯基数量均逐渐增多，对照组饺子皮面筋蛋白游离巯基含量从42.070 9mol/g升至56.891 6mol/g，而AsAFPs组饺子皮面筋蛋白巯基含量从33.466 9mol/g升至41.083 4mol/g；二硫键数量逐渐减少，对照组饺子皮面筋蛋白二硫键含量从16.856 5mol/g降至3.322 1mol/g，而AsAFPs组饺子皮面筋蛋白二硫键从25.100 2mol/g降至16.925 2mol/g，总体表现出AsAFPs组面筋蛋白游离巯基数量低于对照组，二硫键含量高于对照组。这是由于冻藏过程中蛋白质水合环境发生了变化，蛋白发生解聚使得游离巯基数量增加，同时冰晶生长以及重结晶使得饺子皮内面筋蛋白的二级结构受到破坏，导致面筋蛋白内部弱结合的二硫键断裂，使得二硫键含量降低，巯基含量升高。AsAFPs的加入可以抑制大冰晶的生成，减少对面筋蛋白网络结构的破坏，保护其功能特性，从而使得AsAFPs组二硫键含量高于对照组（<0.05），巯基含量低于对照组（<0.05）。

图4 不同冻藏时间AsAFPs对速冻饺子皮面筋蛋白游离巯基和二硫键的影响 Fig.4 Effect of oat antifreeze protein on free thiol and disulfide bond content of quick-frozen dumpling wrapper under different frozen time

蛋白的二级结构主要有-螺旋、-转角、-折叠和无规则卷曲等方式的分子中多肽链的折叠方式。傅里叶红外图谱中的酰胺Ⅰ的信号强弱可以来表征蛋白的二级结构。采用傅里叶仪器对饺子皮面筋蛋白二级结构进行测定，酰胺Ⅰ吸收峰（1 600～1 700 cm）进行基线校正与高斯去卷积技术处理和二阶求导后进行曲线拟合。其中1 650～1 660 cm为-螺旋；1 660～1 700 cm为-转角；1 610～1 640 cm为-折叠；1 640～1 650 cm为无规则卷曲。饺子皮面筋蛋白冻藏过程中的二级结构特征峰及其所占比例如表3所示。

表3 不同冻藏时间面筋蛋白二级结构特征峰值及其所占比例 Table 3 Peak value and proportion of the secondary structure of gluten protein under different frozen time

由表3可知，-折叠和-转角是构成饺子皮面筋蛋白二级结构的主要成分，经过28 d的冻藏，-螺旋作为一种稳定的构象，对照组和AsAFPs组均是呈显著的下降趋势（<0.05），但在整体上AsAFPs组始终要比对照组含量高（<0.05），无规则卷曲整体上呈减小趋势，易溶解的面筋蛋白中会有少量-螺旋结构转化为-折叠和-转角，使得-折叠和-转角含量整体上有些微增加。这是因为抗冻蛋白能够抑制冰晶的生长，减少对面筋蛋白中-螺旋结构的破坏，-折叠与面筋蛋白内二硫键断裂生成的小分子物质发生的聚集有关，由于抗冻蛋白可以抑制氢键和二硫键的断裂，因此可以起到改善面筋蛋白内部结构的作用。

3 结 论

向饺子粉中添加0.5%比例燕麦抗冻蛋白（Oat (L.) Antifreeze Proteins，AsAFPs）能够减少冻藏过程中水分流失，有效缓解饺子皮冻藏过程中的干耗，降低可冻结水含量。由于AsAFPs本身带有的灰褐色，其加入并不能有效提高饺子皮的亮度。抗冻蛋白能够增加速冻饺子皮的弹性（<0.05），降低其硬度（<0.05），提高速冻饺子皮的质构特性。冻藏处理使得面筋蛋白二硫键断裂，游离巯基数量增加，AsAFPs的加入可以抑制重结晶，降低对面筋蛋白网络结构的损害，减少二硫键断裂。对照组面筋蛋白在经历28 d冻藏后，面筋蛋白内氢键发生断裂，二级结构遭到破坏，无规则卷曲、-螺旋含量整体呈现下降趋势，-折叠变化不大、-转角含量整体呈现增加趋势，结构发生改变，AsAFPs的加入减缓了二级结构的变化趋势。