潘 剑 韦 煜 叶定伟 朱 耀

（复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科-复旦大学上海医学院肿瘤学系 上海 200032）

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，也是西方发达国家男性癌症相关死亡的最主要原因［1］。我国前列腺癌发病率逐年升高，但大部分患者初诊时已经处于中晚期［2］。雄激素剥脱治疗（androgen deprivation therapy，ADT）是前列腺癌的基本治疗方式，找到一种能够预测前列腺癌患者对ADT敏感性与抗性的标志物意义重大。到目前为止，只有少数的遗传变异与前列腺癌的侵袭性或治疗反应有关。

趋化因子和趋化因子受体是白细胞进入免疫反应位点的主要介质，白细胞在免疫反应中Th1/Th2细胞的极化、同种异体移植的排斥反应、血管的生成以及肿瘤的发生和转移的过程中发挥重要的作用［3-4］。C-C趋化因子配体2（CCL2），也被称做单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），是C-Cβ趋化因子家族的成员，由巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生，通过CCR2诱导单核细胞、巨噬细胞和其他炎症细胞的趋化［4-5］。CCL 2及其受体CCR2被证明通过不同机制在促进肿瘤的发生和转移中发挥关键作用［6-9］：首先，CCL 2对肿瘤细胞的生长和存活有着直接的促进作用；其次，CCL2通过动员巨噬细胞向组织浸润，调节肿瘤微环境；第三，在骨肿瘤微环境中，CCL2可以促进破骨细胞的成熟；第四，CCL 2可以抑制细胞毒性T淋巴细胞的功能。由于CCL 2在促进肿瘤发生发展中的多重作用，使得CCL 2/CCR2轴成为一个潜在的癌症治疗靶点。对CCL 2的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析也表明，这一趋化因子与肿瘤的发生、发展、转移有关［10-12］。至今，7种CCL 2基因多态性被发现与前列腺癌的患病风险和侵袭性有关［13］：5个位于启动子调控区，1个位于内含子内，1个位于3’端。其中4种SNP与CCL 2蛋白水平的增高有关，但由于SNP的强连锁不平衡，蛋白水平的改变可能源于任何一个功能区域的改变［14］。

以美国高加索人为研究对象的研究［15］表明，当CCL 2基因（rs3760399）的位点发生变异时，患者有着更高的Gleason评分和临床分期，这支持了CCL 2基因变异对于前列腺癌侵袭性的影响。目前没有发现涉及国内前列腺癌患者CCL 2基因多态性与包括临床分期在内的临床病理特征的相关性研究。我们对182例在2014年6月至2019年6月于复旦大学附属肿瘤医院确诊为前列腺癌的患者DNA进行测序，分析临床病理特征与测序结果的相关性；同时，虽然本研究为单中心研究，但大样本的纳入患者具有一定代表性，我们探索性地比较了美国高加索人和本中心人群CCL 2基因（rs3760399）变异频率的差异。

资料和方法

研究对象纳入2014年6月至2019年6月于我院泌尿外科连续收治的、同时具有遗传项目检测意愿的182例前列腺癌患者，患者同意提供信息、血液样本用于研究目的。患者的基线信息来自于随访调查和患者的电子病历，同时通过病理结果和影像报告获得患者的Gleason评分、临床病理分期和转移负荷等病理信息。研究已得到复旦大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准（伦理编号：050432-4-1805C），入组的所有患者均签署了知情同意书，并被告知潜在获益和风险。

基因测序患者的血液来源于我院组织库的-80℃冰箱，使用德国Qiagen公司试剂盒提取全基因组DNA，对启动子区、所有外显子、外显子-内含子接头和30-UTR的PCR产物进行测序，以识别CCL 2中的多态性。琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，BioPhotometer核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf公司）检测DNA的浓度和纯度，定量标化至50 ng/μL。利用于美国ABI公司定制的TaqMan探针进行基因分型，探针两端分别标记有淬灭基团和荧光基团，并利用Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活力酶切探针。反应体系5μL，包括1μL DNA模板、0.125μL引物探针、2.5μL TaqMan Universal Master Mix以及1.375μL去离子水。rs376039的测定ID为C_27478341_10。扩增条件为：98℃下使DNA变性15 s，52℃下退火20 s，68℃下DNA扩增20 s，共38个循环。扩增之后用ABI PRISM 7900HT荧光定量PCR仪检测荧光分布情况，并应用SDS 2.4软件进行基因分型。随机抽出10%的样本做重复试验与验证，所有抽样基因型的吻合度为100%。PCR和测序研究均独立重复。

相关文献的纳入在万方数据库、中国知网、Web of Science、Science Direct、PubMed、Wiley Online Library上搜索前列腺癌、rs3760399基因多态性的文献，搜索时间均从2002年5月到2020年8月。同时查找所纳入文献的参考文献来补充相关文献。结合关键词与主题词来进行搜索，其中英文检索词为CCL 2、rs3760399、polymorphism、prostate cancer；中文检索词为CCL 2、rs3760399、基因多态性、前列腺癌。文献的纳入标准：（1）截至2020年8月，公开发表的前列腺癌和CCL 2基因相关性的英文或中文研究；（2）文献中的基因数据能够量化。排除标准：（1）重复的研究；（2）文献中研究的对象为非人类。文献提取的内容：作者、出版时间、国家或地区、3种基因型患者数目。

统计学处理所有统计分析采用SPSS 22.0软件。连续变量用非配对的t检验，结果用x±s表示；分类变量采用Fisher确切检验法或χ2检验，指标包括转移负荷、临床病理分期、Gleason评分、CCL 2基因型、诊断前列腺癌时的年龄和PSA水平。所有检验均为双侧。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

基因型分布和基本临床病理特征182例患者的信息见表1。在确诊年龄方面，变异组的平均年龄为（65.0±8.7）岁，野生组的平均年龄为（65.4±7.5）岁，两组差异无统计学意义（P=0.768）。在确诊时PSA水平方面，变异组中≤20 ng/mL为8例，＞20 ng/mL为25例；野生组≤20 ng/mL为48例，＞20 ng/mL为116例，两组间差异无统计学意义（P=0.369）。在Gleason评分方面：33例变异组患者中有效例数为32例，其中评分≤7分者6例，＞7分者26例；149例野生组患者中有效例数为148例，其中评分≤7分者32例，＞7分者116例，两组间差异无统计学意义（P=0.718）。在M分期方面，33例变异组患者中有效例数为32例，其中M 0期患者12例，M 1期患者20例；149例野生组患者中M 0期患者43例，M 1期患者106例，两组间差异无统计学意义（P=0.335）。在转移负荷方面，33例变异组中可评估转移负荷的患者19例，其中高转移负荷者7例，低转移负荷者12例；149例野生组中可评估转移负荷的患者107例，其中高转移负荷者69例，低转移负荷者38例。与野生组相比，变异组中高转移负荷患者比例更高，两组间差异有统计学意义（P=0.023）。

表1 本中心182例研究对象的临床特征Tab 1 Clinical characteristics of 182 subjects in our center（n）

中外CCL2基因型频率差异分析根据纳入、排除标准，最终搜索到的有关文献167篇中仅有1篇英文文献纳入此研究［15］，包含美国高加索人前列腺癌病例1 765例，其中变异组120例，野生组1 645例，文献来源于经典杂志，质量较高，是研究者目前能搜查到的纳入患者最多且唯一有涉及CCL 2（rs3760399）基因分布的研究。在rs3760399位点发生变异者中，由于GG型患者只有1例，故将GG和AG放在一起分析，将基因型为AG/GG的列为变异组，基因型为AA者列为野生组。在对比本中心和高加索人群基因型频率差异的分析中，纳入本中心前列腺癌患者182例，其中变异组33例，占比18.1%；野生组为149例，占比81.9%，；纳入美国患者1 765例，其中变异组120例，占比6.8%，本中心rs3760399位点的变异频率比美国患者高，两者间的差异有统计学意义（P＜0.001）。

讨 论

为了更好地评估CCL 2基因多态性对前列腺癌侵袭性的影响，我们基于单中心的前列腺癌患者，分析了CCL 2基因的3种基因型与3个临床病理特征之间的相关性。结果表明，CCL 2基因的多态性与前列腺癌的高转移负荷有关，这一发现为CCL 2参与前列腺癌的发生和转移提供了证据。同时，本中心前列腺癌患者rs3760399位点的变异频率比美国患者高，这可能意味着在对大样本的前列腺癌患者进行长期随访后，理论上国内前列腺癌患者的CCL 2基因型在对无转移生存期的预测中能取到更好的效果。

肿瘤组织中经常可以发现趋化因子及其受体的存在［3-4］。目前CCL 2是其中被研究得最多的趋化因子之一。研究表明，CCL 2可能在前列腺癌的发生和转移中发挥作用［6-7］。CCL 2不仅参与机体对炎症反应的应答，同时可以刺激前列腺癌细胞的趋化、增殖和存活［8-9］。过量表达的CCL 2会增加体内的肿瘤负荷［16-17］。有数据表明，CCL 2的中和抗体能有效抑制前列腺癌细胞的生长［18］。位于基因调控区域中SNP的改变可能会导致基因编码蛋白的多态性，影响编码蛋白的功能，继而导致患癌风险的提高和侵袭性的增高［19-20］。从生物学角度来讲，前列腺癌侵袭性的强弱可以体现在临床病理特征上，如穿刺的Gleason评分、肿瘤临床分期、转移负荷和评估综合风险的D'Amico分类系统等。

研究发现，位于CCL 2基因启动子区域的rs3760399 A/G与高Gleason评分和前列腺根治术后的高临床分期有关，同样位于启动子区域的rs2857654 C/A和其下游的rs2503797 T/C则只与高Gleason评分的发生有关［15］。然而，由于这3个SNP位点的连锁不平衡性，很难在遗传关联分析中区分它们各自对临床病理特征的具体影响。根据文献报道，CCL 2启动子区域中位点的变异可导致转录过程中结合位点的改变，并最终影响CCL 2的表达［14，21-23］。例如，-2518 A/G多态性会影响IFN调节因子-1和Prep1/Pbx2转录因子复合体的结合［21，24］。Matys等［25］则 利 用 网 络 软 件TRANSFA 4.0提出了一种尚未经其他研究验证的假说：上述3个位于启动子区域的SNP位点变异后能够破坏一种叫做Sp1的转录因子结合位点，使得正常细胞更容易转变成前列腺癌细胞。CCL 2基因多态性和前列腺癌侵袭性之间的相关性也可能是由于一种作用机制尚未研究清楚的SNP变异位点，例如同样位于17q12区域的SNP rs4430796，尽管和CCL 2之间的距离大于3.5 Mbp，但它的位点变异同样与前列腺癌患病风险的提高和侵袭性的增高相关［26-29］。SNP位点间的协同作用和具体的生物学机制需要更多的功能实验去证实。

已经有很多研究报道中西方前列腺癌在流行病学与基因组特征方面的差异［30］，而CCL 2基因是前列腺恶性肿瘤侵袭领域研究的热门基因之一。以往关于CCL 2基因的研究大多聚焦于基础研究，未来若要探究CCL 2基因机制的临床转化研究或要发起CCL 2基因相关的临床试验，则需要有中西方CCL 2基因的分布频率数据，本研究探索性地对比中西方CCL 2基因的分布频率差异，可为临床转化研究的开展以及临床试验入组规模的预估提供依据。

本研究是目前国内首个探索CCL 2基因变异频率和其多态性与前列腺癌病理特征相关性的研究。但本研究存在一定局限性：第一，由于随访时间不足且大部分患者还没有对常规的ADT耐药，我们并没有做患者的预后分析；其次，本研究为单中心研究且纳入样本的数量相对有限，结果无法代表全国前列腺癌患者变异频率数据，未来需要在全国多中心纳入更多的样本来获得更加真实的结果，并加入ADT等治疗方式的治疗数据；最后，由于本研究为回顾性研究，患者的选择性偏倚不可避免，但患者为本中心于2014—2019年间以非选择性的连续收入方式纳入，覆盖各个阶段的前列腺癌患者，使得入组人群具有一定人群代表性，且因只有1篇［15］文章披露了CCL 2基因的rs3760399位点变异频率数据，所以本研究中未涉及与除美国高加索人之外人种的CCL 2基因型频率差异分析。

作者贡献声明潘剑 文献调研与整理，数据采集，论文撰写与修订。韦煜 可行性分析，数据统计和分析，论文修订。叶定伟 执行调查，监督指导，论文修订。朱耀 构思与设计，获取资助，论文修订。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。