周汉琛, 刘亚芹, 雷攀登

不同白化期的‘黄山白茶’代谢物差异分析

周汉琛, 刘亚芹, 雷攀登*

(安徽省农业科学院茶叶研究所，安徽黄山 245000)

‘黄山白茶1号’是温度敏感型白化茶树品种，由其鲜叶加工的绿茶，即‘黄山白茶’，具有清香持久、滋味鲜爽等特征。为探究不同白化时期加工绿茶的香气和滋味差异，分析了绿茶中挥发性代谢物、儿茶素、咖啡碱和游离氨基酸含量的变化。结果表明，3个白化时期的‘黄山白茶’在香气和滋味上存在差异。气相质谱(GC-MS)分析表明，共有29个高丰度挥发性化合物被鉴定；主成分分析(PCA)显示芳樟醇、顺-己酸-3-己烯酯、香叶醇、顺-3-己烯醇、()-丁酸-3-己烯酯可能是导致3类绿茶香气存在差异的标志性化合物。滋味成分分析表明儿茶素类物质在白化早期绿茶中含量最低；在白化中期绿茶中略有增加但不显著，而在白化后期绿茶中则显著增加；咖啡碱在3类绿茶中无显著差异；游离氨基酸在白化早期绿茶中含量最高，为干质量的4.4%，而在白化后期绿茶中只占干质量的1.3%。因此，不同时期的‘黄山白茶1号’嫩梢中的代谢物积累存在差异, 使得加工的绿茶风味不同。

茶树；白化品种；黄山白茶；挥发性化合物；儿茶素；游离氨基酸

白化茶树品种是我国重要的特异种质资源，因对气候因子敏感不同，可以分为温度敏感型和光照敏感型[1]。茶树是高度杂合物种，不同品种间的遗传背景差异较大，其内源代谢产物也有差异[2–5]。白化茶树品种作为变异品种，其内源代谢和代谢物积累显著有别于正常叶色品种[5]，其中内源儿茶素类物质在白化茶树品种中的积累普遍较低，这与其合成代谢途径中关键酶基因的表达调控密切相关[6]。白化茶树品种叶片中一般含有较高含量的游离氨基酸，因此由白化茶树品种鲜叶加工的绿茶，多酚类物质含量低但氨基酸含量高，使得茶汤滋味鲜爽苦涩味低，我国重要的名优绿茶‘安吉白茶’，以其口感鲜爽著称。Chen等[7]的研究表明，茶树在遮阴状态下，叶片黄化，内源叶绿体蛋白酶显著积累, 导致叶绿体蛋白水解，使得叶片中的游离氨基酸含量显著上升。此外，Liu等[8]对特异茶树品种‘郁金香’的研究表明，叶绿体在黄化叶片中较小或发育不完整。白化茶树品种在白化期叶片多呈现白色、玉白色或黄白色，其叶绿体发育或受到抑制。

挥发性代谢物是组成绿茶香气的重要成分，尤其是萜烯类化合物，阈值低且普遍具有花果香，对绿茶的香气品质形成具有重要作用。香叶醇、芳樟醇等单萜类物质是绿茶香气的重要贡献者，其合成酶基因主要定位于质体，而白化茶树品种中的叶绿体发育不健全，这可能导致白化品种茶树中萜类物质代谢发生改变[8–10]。Yang等[11]的研究表明，经98%黑暗处理后，茶树叶片黄化，苯丙烷类及苯环类香气化合物含量显著上升，而萜类代谢物质含量在长时间处理后反而持续降低。不同白化茶树品种绿茶因品种差异会使得其特征香气代谢物有差异, 如‘中黄1号’绿茶具有明显的熟玉米香，主要来自二甲基硫醚(dimethyl sulfide)的贡献[12]，而‘正安白茶’绿茶含量较高的挥发性成分为1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇、3-甲基丁醛及2-甲基丁醛等，是其香气的重要组成成分[13]。

‘黄山白茶1号’ (var.‘Huangshanbaicha No. 1’, HSBC#1)是黄山茶树群体中的1个茶树变种，后经过品种选育而成[14]。‘黄山白茶1号’是温度敏感型白化茶树品种，在春季低温时期白化特征较为明显(图1)，叶片呈现白色或玉白色，由其加工而成的绿茶氨基酸含量比‘安吉白茶’绿茶(4.2%～7.4%)高，达4.8%～8.0%，且茶多酚、咖啡碱含量较低，使得茶汤滋味鲜爽，苦涩味较弱[14]。随着春季温度升高，‘黄山白茶1号’叶色开始转变，由白色-黄白色-黄色-黄绿色逐渐变化。本研究分析了‘黄山白茶1号’在不同白化期加工绿茶的滋味成分及香气成分的变化，旨在探究该类白化茶树品种绿茶在不同白化期中的主要生化成分变化，以期为后续研究白化茶树品种绿茶品质形成的机理研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

所用试剂癸酸乙酯、正构烷烃化合物、儿茶素及咖啡碱标准品均购置于Sigma公司，游离氨基酸分析标准品购置于德国SYKAM公司。

供试茶树品种为‘黄山白茶1号’ (‘Huangshan- baicha No. 1’, HSBC#1)，种植于黄山甘白香公司茶树培育基地(29º56′13.44′′ N, 118º24′17.59′′ E)，栽培管理相对一致。

1.2 表型观测和绿茶加工

于2020年3月底至5月初间断对‘黄山白茶1号’新生嫩芽颜色进行拍照，记录当日温度变化情况。分别于4月7日(叶色白化较重)、4月24日(叶色白化较轻)和5月6日(叶色有返绿)采摘一芽一叶鲜叶，采收后在室内摊放2 h后杀青，杀青温度为200℃～250℃，杀青后室内摊凉3～5 min进行初烘, 初烘温度为100℃～110℃，约10～15 min，复烘温度80 ℃～90℃，约30 min。绿茶样品置于-40 ℃冰箱储藏备用。

1.3 感官审评

参照国家茶叶感官审评标准GB/T 23776—2018进行感官审评，准确称取3.0 g绿茶样品，加入150 mL沸水冲泡4 min，滤出茶汤，由3名专业审茶员主要对茶汤香气及滋味进行描述。

1.4 挥发性物质提取和分析

挥发性化合物提取参照Wang等[15]的方法并略有改动。准确称取0.2 g绿茶粉末于20 mL萃取瓶中，加入5 mL沸水，于70 ℃水浴平衡5 min，利用65mol/L PDMS/DVB SPME萃取头(Supelco, Bellefonte PA)于70 ℃下吸附30 min用于GC-MS分析。其中，吸附过程中加入10L 0.01%癸酸乙酯为内标化合物。

参照Han等[16]的方法，采用气相质谱联用仪Agilent 7697A-7890A分析挥发性物质，气相色谱柱为DB-5 (30 m×0.25 mm×0.25m; Agilent)。GC程序：气相不分流，流速为1.0 mL/min，载气为氦气，色谱柱升温程序为：初始温度50℃，保持1 min; 以10℃/min速率上升到100℃，并保持1 min；然后以4℃/min速率上升到200℃，并保持1 min；以16℃/min上升到280 ℃，并保持7 min。

依据NIST (National Institute of Standards and Technology)数据库和保留指数(retention index,RI)进行化合物鉴定。挥发性化合物含量根据化合物峰面积与内标峰面积之比计算，以百分数(%)表示。

1.5 儿茶素、咖啡碱的提取和测定

绿茶样于研磨机中粉碎，准确称取1.0 g茶粉,分3次加入30 mL沸水并于90℃水浴中震荡5 min, 过滤茶汤后定容至100 mL。将茶汤稀释400倍后用0.22m微孔水系滤膜过滤, 用日本岛津公司2010A液相色谱仪测定儿茶素及咖啡碱含量，柱温40℃，流动相A为1%乙酸溶液，流动相B为乙腈，流速1.0 mL/min。梯度洗脱条件为B相在0～20 min由10%线性变化至13%，20～40 min由13%线性变化至30%，40～41 min由30%线性变化至10%。以标准品绘制标准曲线，计算儿茶素及咖啡碱含量。每个样品重复3次。

1.6 游离氨基酸的测定

游离氨基酸提取方法同上，稀释200倍。用德国SYKAM 433D氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。色谱柱为LCA K07/Li，柱温为38℃～74℃梯度升温；流动相A为pH2.9柠檬酸锂溶液，流动相B为pH 4.2柠檬酸锂溶液，流动相C为pH 8.0柠檬酸锂溶液；洗脱泵流速为0.45 mL/min，衍生泵流速为0.25 mL/min，进样体积10L。以标准品响应面积计算游离氨基酸含量。每个样品重复3次。

1.7 数据处理

利用SPSS 19.0软件进行ANOVA计算，采用Duncan (D)方差分析法对不同绿茶样品中代谢物含量差异进行分析(<0.05)；采用SMICA.P软件对茶叶样品中化合物进行主成分分析(principal compo- nent analysis, PCA)。

2 结果和分析

2.1 白化表型和风味

‘黄山白茶1号’为温度敏感型白化茶树品种, 在白化前期，环境温度为18℃～20℃，叶片白化程度较重，呈现玉白色；在白化中期，环境温度为20℃～23℃，叶片呈现黄白色，白化现象有所减轻；在白化后期，环境温度达23℃以上，‘黄山白茶1号’叶片逐渐呈现黄色，有返绿现象(图1)。感官审评结果表明，3个时期绿茶香气类型均为清香型, 但白化前期和中期绿茶香气清香的持久度和强度高于白化后期；滋味评价表明，白化前期绿茶的鲜爽度较高，而醇厚度低于中期和后期，此外白化前期和中期的绿茶茶汤有回甘，而后期则没有。

图1 ‘黄山白茶1号’不同白化时期表型

2.2 挥发性成分鉴定

通过NIST数据库检索和保留指数比对，3类绿茶样品中共鉴定出29个高丰度挥发性成分(表1)。其中，有13个挥发性成分相对含量在3类绿茶样品中无显著差异(>0.05)，分别是己醛、庚醛、芳樟醇氧化物I和II、壬醛、苯乙醇、环氧芳樟醇、十二烷、癸醛、2-甲基丁酸-顺-3-己烯酯、香叶醛、吲哚以及橙花叔醇，其余16个挥发性成分丰度在3类绿茶样品中存在显著差异(<0.05)，尤其是顺-3-己烯醇、芳樟醇、香叶醇、顺-己酸-3-己烯酯4个化合物在3类绿茶中的相对含量差异较大。

2.3 挥发性成分的差异分析

以挥发性成分相对含量为变量，利用SIMCA软件进行主成分分析，结果表明，白化前期‘黄山白茶1号’的挥发性成分与另外两个时期有显著差异(图2: A)，且白化中期与白化后期的也有一定差异，而导致差异的标志性化合物主要是芳樟醇(C11)、香叶醇(C21)、()-丁酸-3-己烯酯(C15)、顺-3-己烯醇(C4)、顺-己酸-3-己烯酯(C24)等(图2: B)。芳樟醇在白化前期的相对含量为(22.918±3.296)%，随着叶色转变其相对含量显著下降，白化后期下降为(7.206± 1.790)%。

通过正交偏最小二乘判别分析(orthogonal par- tial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)法对差异化合物进行分析，以VIP>1且<0.05筛选差异化合物，结果表明，白化前期与中期绿茶的差异化合物有顺-己酸-3-己烯酯(VIP=2.44)、芳樟醇(1.95)、顺-3-己烯醇(1.75)、香叶醇(1.38)、()-丁酸-3-己烯酯(1.28)、水杨酸甲酯(1.16)和2-甲基丁酸-顺-3-己烯酯(1.00)等7个化合物。除水杨酸甲酯在白化中期‘黄山白茶’中的相对含量上升外，其余6个化合物相对含量均呈现下降趋势(表1)。从白化前期和后期‘黄山白茶’挥发性组分中筛选到5个差异化合物，分别是芳樟醇(2.45)、顺-己酸-3-己烯酯(2.17)、香叶醇(1.85)、顺-3-己烯醇(1.61)、()-丁酸- 3-己烯酯(1.22)。

表1 ‘黄山白茶’绿茶中挥发性化合物的鉴定

同行数据后不同字母表示差异显著(<0.05)。

Data followed different letters indicate significant difference at 0.05 level.

图2 不同白化期‘黄山白茶’绿茶挥发性成分PCA分析。A: PCA; B: 差异代谢物。

2.4 滋味成分分析

滋味成分分析结果表明，与鲜味相关的化合物没食子酸(GA)在白化中期绿茶中的含量最高(<0.05)；儿茶素类物质具有收敛性，与茶汤涩味、收敛性相关，其含量随白化程度减轻而增加，其中简单型儿茶素类物质总量在白化前期和中期的变化不显著(>0.05)，而白化后期的儿茶素物质总量显著上升(<0.05)(表2)；酯型儿茶素类物质EGCG、GCG、ECG、CG的变化趋势与简单型儿茶素类化合物相同，在白化后期绿茶中的含量显著增加(<0.05); 咖啡碱含量在3类绿茶中的变化不大, 无显著差异。

游离氨基酸含量随白化程度减轻呈现下降趋势(表2)，其中茶氨酸含量变化最为显著，在白化前期含量达干质量的4.4%，而后期降到1.3%。与鲜味相关的游离氨基酸天冬氨酸和谷氨酸在白化前期和中期绿茶中变化并不显著(>0.05)，而在白化后期含量显著下降(<0.05)；与甜味相关的游离氨基酸在白化前期的含量较高，在白化后期较低；与苦味相关的游离氨基酸在白化前期含量较高。PCA分析结果表明，儿茶素类物质含量在白化后期才出现剧烈变化(图3: A)，而游离氨基酸含量在3类绿茶中的变化较大(图3: B)。

图3 不同白化期‘黄山白茶’绿茶中儿茶素类物质和游离氨基酸的PCA 分析。A: 儿茶素类物质；B: 游离氨基酸。

3 结论和讨论

3.1 挥发性成分的变化

本研究通过HS-SPME-GC-MS对‘黄山白茶’中的主要挥发性成分进行了鉴定分析，结果表明，共有29个高丰度化合物被鉴定，且主要是绿茶中的香气组分[17]。PCA分析结果表明返绿后的‘黄山白茶’显著有别于白化时期的绿茶，且主要差异成分是芳樟醇、香叶醇、()-己酸-3-己烯酯、顺-3-己烯醇和()-丁酸-3-己烯酯等，推测这些挥发性成分的不同是导致绿茶香气审评差异的因素。在本研究中,同一发育状态下(一芽一叶)，叶片返绿‘黄山白茶’中的芳樟醇及香叶醇含量显著低于叶片白化时期的绿茶，推测环境温度的改变，使得叶片转绿进程中，内源萜类合成途径受到调控，进而影响了萜类物质的生物合成。近期即有研究表明低温处理下,茶树质体中的萜类合成MEP (methylerythritol 4- phosphate)途径受到调控，使得萜类合成相关基因，如、、等显著上调表达[18]。

表2 不同白化期‘黄山白茶’绿茶滋味成分含量(mg/g)

同行数据后不同字母表示差异显著(<0.05)。

Data followed different letters indicate significant difference at 0.05 level.

此外，本研究中，醛类化合物，如己醛、庚醛、芳壬醛、癸醛等在不同白化时期绿茶中的丰度差异较小。已知醛类化合物多来源于脂肪酸类物质的裂解，在茶叶加工过程中脂类化合物可氧化裂解产生多种挥发性成分，包括醛类、酸类、酮类等[19]。脂肪酸合成途径在植物中较为复杂，涉及多条合成途径[20]。基于脂类物质在茶叶中较为丰富，约占干质量的2%[21]，推测醛类物质的生成与茶叶加工过程密切相关。本研究中的绿茶加工过程相对一致，这可能是醛类化合物含量差异不显著的原因。

3.2 滋味成分的变化

对‘正安白茶’的研究表明，儿茶素类物质相对含量在白化期呈现上升趋势，尤其在复绿期含量显著增加；游离氨基酸则以白化期的含量最高[22]。在本研究中，白化早期‘黄山白茶’中的游离氨基酸总量显著高于白化中期和晚期，而儿茶素类物质含量则显著低于白化晚期，这与‘正安白茶’[22]的研究结果一致。在白化早期‘黄山白茶’中游离氨基酸总量达干质量的4%，而此时儿茶素类物质，主要负责茶汤收敛性的物质含量相对较低，使得茶汤鲜爽而醇厚度稍欠；白化中期‘黄山白茶’儿茶素类物质含量增加使得茶汤醇厚度增加。此外，白化早期和中期绿茶茶汤滋味有回甘，而白化后期绿茶则没有, 表明茶汤甜醇度与槲皮素-3--芸香糖苷、-氨基丁酸和咖啡碱有显著相关性[23]。另有研究表明，类黄酮糖苷物质的增加可使得茶汤回甘度降低[24]，后期研究中可通过分析该类物质的差异，深入研究影响不同白化期绿茶风味改变的关键化合物。

‘黄山白茶1号’为温度敏感型白化茶树品种,随着温度上升叶色逐渐返绿。Feng等[5]的研究表明，相同时期正常叶色茶树品种‘福鼎大白’中的儿茶素类物质总量显著高于‘安吉白茶’、‘郁金香’、‘天台黄茶’等白化、黄化特异茶树品种，这表明茶树正常叶色叶片利于积累较多的儿茶素类物质。转录因子和等参与调控了类黄酮生物合成代谢途径关键酶基因的表达变化[25]。近期研究表明茶树转录因子参与调控花青素合成酶ANS和花青素还原酶ANR基因的表达，影响了茶树嫩梢中儿茶素类物质的积累[26]。此外，低温、弱光使得茶树叶片中的儿茶素类物质积累显著降低，而显著促进游离氨基酸等物质的积累[25]。本研究中，白化时期的‘黄山白茶’积累更多的游离氨基酸。有研究表明[11,27–29]，白化、黄化茶树叶片中易积累更多的游离氨基酸，这与叶绿体蛋白水解及茶氨酸合成酶的上调表达有关。

综上所述，白化茶树品种‘黄山白茶1号’随温度变化，叶色发生转变，内源代谢物的积累产生变化，如挥发性化合物、儿茶素类物质和游离氨基酸等，使得鲜叶加工的绿茶风味产生差异。

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Metabolites Profiling of Green Tea Processed from ‘Huangshanbaicha No. 1’ Cultivar at Different Albino Stages

ZHOU Hanchen, LIU Yaqin, LEI Pandeng*

(Tea research institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Huangshan 245000, Anhui, China)

Teacultivar ‘Huangshanbaicha No. 1’ (HSBC#1) was bred from natural albino mutants of tea plants. The green tea processed from HSBC#1 possess umami, mellow taste and fresh odor. For investigating the metabolite profile of green tea produced from three albino stages (early, middle, and late) of HSBC#1, the main components in tea, such as volatile compounds, catechins, caffeine, and free amino acids, were analyzed. The green teas produced from different stages of HSBC#1 showed the different odor and taste via sensory evaluation. A total of twenty-nine volatiles was identified and quantified. The principal component analysis indicated that the top five differential volatiles were geraniol, ()-hexanoic acid, 3-hexenyl ester, linalool, ()-3-hexen-1-ol, and ()-butanoic acid, 3-hexenyl ester, approximately contributing to the differences in aroma among green teas. Catechins were lower concentrated in early-stage green tea, but their concentrations increased significantly in late-stage green tea. The amount of caffeine had no difference in three types of green tea. The total content of free amino acids in early-stage green tea accounted for about 4% of dry weight, while that in late-stage green tea only for 1.3% of dry weight. Therefore, the differences in metabolites among tender shoots of HSBC#1 at different albino stages lead to the difference in the flavor of green tea products.

; Albino tea cultivar; Huangshanbaicha; Volatile compound; Catechin; Free amino acid

10.11926/jtsb.4461

2021-06-08

2021-08-25

黄山市科技计划项目(2018KN-03)；安徽省农业科学院创新团队项目(2021YL036)资助

This work was supported by the Project of Science and Technology in Huangshan (Grant No. 2018KN-03), and the Project for Innovation Team of Anhui Academy of Agricultural Sciences (Grant No. 2021YL036).

周汉琛(1989～ )，女，博士，研究方向为茶树生物化学及分子生物学。E-mail: Tuesday1011@163.com

. E-mail: lpteagle@126.com