张瑞景，王 浩，蔡凤娇，夏 燕，汪江波，徐 健*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 发酵工程教育部重点实验室 工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068；2.湖北琪谱检测技术有限公司，湖北 武汉 430068）

白酒是以粮谷为主要原料，以大曲、小曲、麸曲酶制剂及酵母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、陈酿、勾调而制成的饮料酒[1]，是世界上历史悠久的六大蒸馏酒之一[2-3]。白酒中的主要成分是乙醇和水，约占总量的98%；微量成分约占总量的2%，包括酯类、酸类、醇类、醛类等成百上千种化合物，这些物质决定了白酒的风格与品质[4]。有机酸类物质约占微量成分的14%～16%，在酒体中起到减轻苦味、增长后味、使酒体丰满、促进回甜、增加醇和度等作用，是白酒的主要呈味物质，也是酯类物质生成的重要前体物质[5-7]。研究发现，同一有机酸在各香型白酒中的含量存在差异，如乙酸在药香型原酒中含量高达2.8 g/L、酱香型原酒中含量为1.42 g/L、浓香型原酒中含量仅为0.21 g/L[8]。此外，相同香型白酒的不同样品中，有机酸的种类和浓度含量也差异较大。李先贵等[9]的研究结果表明，四种典型酱香型白酒中C2～C8的低碳脂肪酸的含量分别为1.7 g/L、1.4 g/L、2.2 g/L和1.8 g/L。张明等[10]对枝江柔雅白酒及其他六种浓香型白酒中的有机酸含量进行检测，研究表明，白酒中乙酸、乳酸、己酸和丁酸的含量约占总酸含量的90%[6]，是构成白酒中总酸的主要的四种有机酸。因此，准确测定白酒样品中乙酸、乳酸、己酸、丁酸的含量，对实际生产具有重要的参考及指导作用。

目前，白酒中有机酸的检测方法主要包括气相色谱法[11-12]、液相色谱法[13-14]、离子色谱法[15-16]和质谱法[17-18]等。乙酸、丁酸和己酸等挥发性的有机酸多采用气相色谱法进行测定[19]，但在检测过程中往往存在峰拖尾的现象[20-21]；非挥发性的有机酸若使用气相色谱法进行测定还需进行衍生化[17]，处理过程相对繁琐。宋卫得等[15]采用离子色谱法同时检测酒样中的乳酸、乙酸、丁酸等物质，但需先调节样品pH值至5.2～6.5的范围内，再将样品高速离心后进行稀释，最后经滤膜过滤，收集样液进行检测，样品制备过程相对复杂。乳酸、乙酸、丁酸等也可以用液相色谱法检测[22-23]，王芳等[24]用液相色谱同时检测白酒中的四大酸，但是存在基线漂移较大（超过60 mAU）、检出限高（10 mg/L）的缺点。

本研究采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法同时检测白酒中乳酸、乙酸、丁酸和己酸四种主要有机酸的含量，对该方法的标准曲线、线性范围、检出限、重复性及加标回收率进行了测定。同时，研究了不同乙醇体积分数（1%～70%）对四种有机酸定性和定量的影响，并提出了有效的改良策略。以期得到一种便捷、高效、准确测定白酒中四种有机酸的方法，对实际生产具有一定指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙酸、丁酸、己酸和乳酸标准品：德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇（色谱级）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；甲磺酸（色谱级）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；乙醇（色谱级）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

白酒样品：均由湖北工业大学酿酒中试基地提供。

1.2 仪器与设备

Thermo U3000 HPLC、Acclaim OA色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：赛默飞世尔科技公司；AS 220.R1电子天平：波兰RADWAG公司；Direct-Q 5 UV纯水仪：美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

分别取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL和7.0 mL无水乙醇置于10 mL的容量瓶中，加入0.5 mL用纯水配制的10 g/L四种有机酸母液，用纯水定容，得到体积分数1%～70%的乙醇-酸混合溶液。取0.2 mL酒样用超纯水定容至5 mL，摇匀后采用0.22 μm针头式滤器过滤、备用。

1.3.2 HPLC分析条件

本试验所用HPLC配备Acclaim OA色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和紫外检测器，柱温为25 ℃，检测波长为210nm，流动相流速为0.8mL/min。流动相包括A：100mmol/L硫酸钠溶液；B：100%乙腈；C：2.5 mmol/L甲磺酸溶液，梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3.3 标准溶液的配制

分别准确量取50 μL乳酸、乙酸、丁酸和己酸标准品于10 mL的容量瓶中，并置于电子天平上称质量，用10%乙醇溶液定容，得到四种有机酸标准溶液的母液。分别量取0.02 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL和0.8 mL母液置于10 mL的容量瓶中，用纯水定容得到不同质量浓度（8～430 mg/L）混标，经0.22 μm针头式滤器过滤，4 ℃保存备用。

1.3.4 方法的精密度试验

参考GB/T 6379.3—2012/ISO 5725-3：1994《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第3部分：标准测量方法的中间度量》[25]的方法进行，按1.3.2的实验方法，每个样品重复测量6次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 加标回收率试验

向本底值约为100 mg/L的标样中分别加入约40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L和240 mg/L的标样，按1.3.2的方法进行测量，每个样品重复测量6次。计算标样加标回收率。

取0.1 mL白酒样品置于5 mL的容量瓶中，分别加入不同浓度的标样，用超纯水定容，摇匀后经0.22 μm针头式滤器过滤后备用，按照1.3.2的方法进行测量，计算样品加标回收率。

1.3.6 白酒样品中总酸含量的测定

白酒样品中总酸含量的测定参考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[26]进行。

1.3.7 数据处理

根据标准溶液的浓度及由HPLC测得的对应峰面积，通过Thermo U3000 HPLC自带的Chromeleon 7软件拟合得到标准曲线及相关系数，并用该软件进行平均值、RSD的计算。用Excel 2010进行回收率的计算。

2 结果与分析

2.1 四种有机酸的定性

在前期试验中，通过对比乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、2.5 mmol/L甲磺酸-乙腈、100 mmol/L Na2SO4-2.5 mmol/L甲磺酸-乙腈等不同流动相组合，结果发现，采用100 mmol/L Na2SO4-2.5 mmol/L甲磺酸-乙腈流动相体系时，乳酸、乙酸、丁酸和己酸都能较好的分离（分离度均＞1.5），如图1所示，四种酸的峰形较为对称、尖锐。此外，四种酸类物质能够在25 min内全部出峰，检测时间较短。

图1 四种有机酸混合标准溶液的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of four organic acids mixed standard solution

2.2 线性关系及检出限

采用1.3.2的方法对配制的不同质量浓度的系列标准溶液进行检测，用Chromeleon7软件对测得的峰面积（y）和质量浓度（x）拟合得到标准曲线。四种有机酸的保留时间、线性范围、标准曲线回归方程、相关系数及检出限见表2。

表2 四种有机酸HPLC分析的保留时间、线性范围、标准曲线回归方程、相关系数及检出限Table 2 Retention time,linear range,standard curve regression equation,correlation coefficient and limit of detection of four organic acids analyzed by HPLC

由表2可知，四种有机酸标准曲线的相关系数R2均＞0.999 7，能达到GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[27]的技术要求，说明该方法线性良好，可满足定量检测的要求。参考GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法理化部分 总则》[28]以信噪比（S/N）=3确定检出限，除丁酸外检出限均在1 mg/L以下，能够满足实验室的检测需求。

2.3 方法的精密度试验

选取17～19 mg/L、120～160 mg/L及245～315 mg/L三个质量浓度范围的标样，用1.3.2的方法进行6次平行测定，计算四种有机酸在不同质量浓度下的测定结果的平均值及RSD，结果见表3。

表3 精密度试验结果（n=6）Table 3 Results of precision tests (n=6)

由表3可知，当乙酸、丁酸和己酸的质量浓度较低（17～19 mg/L）时，RSD在0.53%～1.54%之间，在中、高质量浓度（124～313 mg/L）时，RSD＜0.5%，在高质量浓度时的重复性比低质量浓度时好；乳酸在三种不同质量浓度下RSD均＜0.3%。四种有机酸的精密度试验结果相对标准偏差均＜1.6%，说明该方法的精密度良好，可用于白酒样品的检测。

2.4 方法加标回收率试验

在本底值约为100 mg/L的标样中，依次进行四个不同质量浓度添加水平下的回收率实验，每个样品平行测定3次，计算平均回收率和RSD，结果如表4所示。

表4 加标回收率试验结果（n=3）Table 4 Results of adding standard recovery rate tests (n=3)

续表

由表4可知，乳酸的加标回收率在97.24%～100.75%之间，乙酸的加标回收率在98.51%～104.34%之间，丁酸的加标回收率在98.71%～103.54%之间，己酸的加标回收率在100.07%～104.40%之间，四种有机酸的加标回收率均能达到GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[27]的技术要求，RSD均＜0.5%，表明该方法的测定结果准确度较好。

2.5 乙醇体积分数对四种酸出峰效果的影响

白酒中乙醇的含量较高，体积分数在25%～68%之间[29-30]。乙醇由于比水、乙腈、甲醇等常用流动相的极性弱，因此在反相色谱系统中有着更强的洗脱力[31]。在选用水-乙腈作为流动相的反相色谱系统中，乙醇的存在可能会对样品中四种有机酸的保留时间造成影响，进而影响酒样中四种有机酸的定性及定量。研究不同乙醇体积分数对乳酸、乙酸、丁酸和己酸保留时间、峰形的影响，其结果如图2和表5所示。

表5 不同乙醇体积分数对丁酸、己酸保留时间的影响Table 5 Effect of different alcohol volume fraction on the retention time of butyric acid and hexanoic acid

图2 不同乙醇体积分数对乳酸、乙酸保留时间及色谱峰的影响Fig.2 Effect of different alcohol volume fraction on the retention time and chromatographic peak of lactic acid and acetic acid

由图2可知，不同乙醇体积分数对乳酸和乙酸的保留时间影响较大，乙醇体积分数在30%以上时，两种有机酸不能有效分离且所得峰形较差。乙醇体积分数在5%和20%时，乳酸和乙酸可以分开，但是乙酸峰形较差，且两种有机酸的保留时间与标样相比提前0.15 min以上。当乙醇体积分数＜3%时，乳酸和乙酸的峰形与标样相比变化较小，保留时间与标样相比差值在0.1 min以内，两种有机酸的定性和定量基本不受影响。

由表5可知，不同乙醇体积分数对丁酸、己酸保留时间的影响较小，当乙醇体积分数从1%提高至70%时，两种酸的保留时间几乎没有变化（RSD＜0.1%），这表明该方法中己酸和丁酸的定性定量不受乙醇体积分数的影响。因此，对于只需测定己酸或丁酸的白酒样品可不用稀释，经0.22 μm滤膜过滤后直接进行检测。在用此方法同时测定四种有机酸时，由于白酒中乙醇体积分数较高，尤其是高度酒乙醇体积分数通常在40%以上[29]，需要对白酒样品进行稀释处理，将乙醇含量控制在3%以下。

2.6 白酒样品的测定

分别准确量取0.2 mL的浓香型、酱香型和清香型白酒样品置于5 mL容量瓶中，用超纯水定容，经0.22 μm滤膜过滤后，按1.3.2的色谱条件进行四种有机酸的检测，结果见表6。

由表6可知，在三种酒样中四种有机酸的含量占总酸的89%以上，是其主要的有机酸，且由于3种酒样香型不同，四种有机酸在各酒样中的含量差异较大。酒样1为浓香型白酒，己酸是主体香味成分己酸乙酯的前体物质之一，其含量与己酸乙酯含量呈正相关[32]，在此样品中己酸含量达到0.9 g/L，在四种酸中含量最高；乳酸含量达到0.8 g/L，处于较高水平，说明该酒较好[5]；乙酸含量相对较低。酒样2为酱香型白酒，该酒中乙酸的含量最高，达到1.2 g/L，占总酸含量的70%以上；其次为乳酸，含量为0.36 g/L。酒样3为清香型白酒，乙酸是主体香味成分乙酸乙酯的前体物质之一，含量达到0.9 g/L，占总酸含量的一半以上；乳酸含量为0.4 g/L，同样是该酒样主要的酸类物质之一。三种酒样的测定结果与其香型特点相符。上述结果表明，该方法能准确检测出各酒样间同一有机酸含量的区别及同一酒样中不同有机酸含量的差异。

表6 不同酒样的测定结果Table 6 Determination results of different Baijiu samples by HPLC

3 结论

本研究建立了高效液相色谱法同时测定白酒中乳酸、乙酸、丁酸和己酸含量的方法，其标准曲线相关系数、精密度、加标回收率均能达到GB/T 27404—2008的技术要求。通过研究不同体积分数乙醇对四种有机酸保留时间和峰形的影响，发现在实际检测中将白酒样品的乙醇体积分数稀释至3%以内，可以提高检测结果的准确性。采用该方法对三种不同白酒样品中的四种有机酸进行测定，可准确检测出各酒样中乳酸、乙酸、丁酸和己酸的含量差异。本研究所提出的方法可用于不同白酒样品中四种有机酸含量的检测，能快速、准确的获得结果，对白酒的勾调具有重要的指导意义。