刘来鑫，樊 圃

(中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所 医学分子生物学国家重点试验室，北京 100005)

五羟色胺(5-Hydroxytrypatamine,5-HT)又称血清素(serotonin)，是一种神经递质，其生物学功能复杂多样，在哺乳动物中不仅参与认知、社交、学习记忆、情绪、睡眠等多种生理过程[1-2]，也是胃肠神经系统的重要调节因子[3]。损伤或改变5-HT神经传递会导致自闭、抑郁、焦虑、精神分裂等精神疾病[3]，一些治疗抑郁、焦虑的药物也会影响5-HT系统的活性[4]。L-色氨酸(L-tryptophan)是5-HT合成的重要底物，哺乳动物缺乏合成L-色氨酸所需的基因，因此L-色氨酸需要从低等生物中获取[5]。L-色氨酸进入动物体内后，在色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,Tph)催化下变成5-羟色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)，由于哺乳动物体内Tph含量较少，因而这一过程是5-HT生物合成的限速步骤。目前已知哺乳动物体内存在2种色氨酸羟化酶：色氨酸羟化酶1(tryptophan hydroxylase-1,Tph1)和色氨酸羟化酶2(tryptophan hydroxylase-2,Tph2),其中Tph2参与中枢神经系统中5-HT的合成，而Tph1参与肠道和其他外周组织中5-HT的合成。由于5-HT不能通过血脑屏障，因而外周合成的5-HT无法进入中枢神经系统[6],这2个5-HT合成系统相互独立。Tph2基因敲除会导致小鼠体质量降低，焦虑水平、社会行为等发生改变[7]，但尚未见Tph2基因敲除对大鼠行为影响的相关研究报道。与小鼠相比，大鼠具有更复杂的社会行为、认知能力[8]。为此，本研究比较了雄性野生型(WT)大鼠和Tph2基因敲除型(Tph2KO)大鼠的体质量、焦虑水平、社会行为、社会新奇认知能力的差异，旨在为研究大脑中5-HT系统如何调控大鼠行为的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

通过CRISPR/Cas9方法构建的基于SD背景的Tph2KO大鼠(第6外显子(98 bp)及其前128 bp序列被敲除，形成移码突变)由北京大学生命科学学院饶毅惠赠。为扩大种群将获得的Tph2KO大鼠与购自维通利华的雄性野生型(WT)大鼠进行杂交扩繁3代以上，获得的第4代大鼠建立封闭群(以非近亲交配方式进行繁殖的一个种群)，封闭群中杂合子(Tph2+/-)大鼠交配获得的Tph2KO大鼠与WT大鼠用于行为试验。大鼠均在北京脑科学研究中心和中国军事医学科学院国家蛋白质中心动物房采用独立通风笼具进行饲养。

考虑到雄性动物无雌性动物周期性生理指标的波动，因此本研究采用雄性大鼠进行行为试验。出生的后代10 d左右剪脚趾进行编号，剪下的组织留作基因型鉴定，出生30 d后进行分笼。饲料和水充足供应，饲养温度恒定为25 ℃，相对湿度为40%～60%。每天中午12:00至次日凌晨0:00为暗周期。所有动物的饲养和使用均符合北京脑科学研究中心和中国军事医学科学院国家蛋白质中心动物伦理委员会的要求和规定。

1.2 主要试剂和仪器

蛋白酶K(美国Millipore公司)，一步法基因分型裂解液(上海听水生物科技有限公司)。Leica CM3050s冰冻切片机(德国Leica公司)，色谱柱(MicroSolv技术公司)，Vanquish Flex高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)，旷场试验装置、高架十字迷宫装置、行为录像软件(上海欣软信息科技有限公司)。

1.3 Tph2KO大鼠的鉴定

取出生10 d左右雄大鼠的脚趾进行消化裂解，采用PCR方法对其进行鉴定。根据NCBI中的Tph2基因序列(GenBank ID:317675)，使用Primer 5.0设计引物，由睿博兴科公司合成。Tph2引物序列为：F:5′-CCTCCCAAGGACAGACACAT-3′；R:5′-GGTGAGTGCCCCTTGTCTTA-3′。PCR反应体系：组织裂解液0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taqmix 7.5 μL，ddH2O 1 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性25 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物使用2%琼脂糖进行凝胶电泳。

1.4 Tph2基因敲除对大鼠体质量和大脑中缝核5-HT含量的影响

1.4.1 对大鼠体质量的影响 用电子秤称取10周龄雄大鼠的体质量，比较WT和Tph2KO大鼠体质量的变化。

1.4.2 对大鼠大脑中缝核5-HT含量的影响 采用高效液相色谱串联高分辨质谱检测大鼠大脑中缝核(5-HT神经元胞体聚集区)5-HT的含量。首先绘制标准曲线，用甲醇稀释5-HT标准储备液，制备不同浓度(3，10，30，100，300，1000 nmol/μL)的5-HT标准溶液，取各浓度标准溶液2 μL上样进行高效液相色谱串联高分辨质谱分析。条件为：色谱柱：Cogent diamond hydride column (MicroSolv，4 μm，150 mm×2.1 mm)；流动相：A相为质量分数0.1%甲酸水溶液，B相为质量分数0.1%甲酸乙腈；液相梯度：0 min，90% B；1 min，90% B；16 min，30% B；18 min，30% B；20 min，90% B；25 min，90% B；上样体积2 μL；柱温35 ℃；流速0.4 mL/min。以标准液中5-HT浓度(nmol/μL)为横坐标(x)，以相应峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线。

取WT和Tph2KO大鼠各3只，分别称质量，腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠(剂量为40 mg/kg)麻醉，用4 ℃生理盐水灌流将血液冲洗干净；断头，迅速在4 ℃生理盐水中分离出大鼠大脑中缝核核团，擦干表面水分称质量；脑组织用4 ℃、体积分数80%的甲醇匀浆(甲醇用量为1.5 mL/mg)，-20 ℃沉淀1 h，4 ℃下14 000 r/min离心10 min，取上清液进行高效液相色谱串联高分辨质谱进行分析，根据标准曲线计算大鼠脑组织中5-HT含量。试验以体积分数80%的甲醇为空白对照组。

1.5 Tph2基因敲除对大鼠行为的影响

1.5.1 旷场试验 旷场试验装置由上海欣软公司提供。将试验大鼠置于旷场中心区域(设备中央50 cm×50 cm区域)，允许其自由探索15 min，用摄像机记录其运动轨迹。利用软件对所拍摄的视频进行逐帧分析，统计试验大鼠进入中心区域的时间和次数。

1.5.2 高架十字迷宫试验 高架十字迷宫装置(上海欣软公司提供)是由2个开放臂和2个闭合臂从中央平台伸出来组成。将试验大鼠面向开放臂置于迷宫中央平台，并允许其探索5 min，用摄像机记录其运动轨迹。利用软件对所拍摄的视频进行逐帧分析，统计试验大鼠进入开放臂和闭合臂的时间和次数。

1.5.3 强迫游泳试验 为了解Tph2基因敲除是否会导致大鼠抑郁样行为，采用强迫游泳行为范式检测大鼠在试验过程中静止漂浮在水中的时间。静止漂浮的时间越长，表明大鼠可能具有更高的抑郁程度。第1天预测试：在高50 cm直径30 cm的透明塑料桶中注入约30 cm深的水(水温≈室温24 ℃)，确保大鼠在游泳或漂浮时后肢不接触桶底，将试验大鼠放入水中强迫游泳15 min。正式试验在预测试24 h后进行，将试验大鼠放入水中强迫游泳5 min，在水桶的侧面架设摄像机进行拍摄，使用软件对拍摄的强迫游泳视频进行逐帧分析，统计试验大鼠在5 min的强迫游泳时间内静止漂浮的时间。

1.5.4 位置偏好测试 三室试验设备(100 cm×40 cm×30 cm)由北京功致斯美有机玻璃公司提供，有一个中央室和左右两个侧室，大鼠可通过中央室与侧室间的开口自由进出。侧室内各有一个束缚器。将试验大鼠放在中央室，让其自由探索试验场地10 min，用摄像机记录大鼠探索的过程，利用软件逐帧统计该阶段试验大鼠探索两侧室的时长。

1.5.5 社会互动测试 为测试Tph2基因敲除是否会导致大鼠社交能力的变化，采用三室试验设备来检测大鼠的社会性。将试验大鼠引导至中央室，封锁两侧室的入口。将1只陌生大鼠(Stranger 1)随机放在某一侧室的束缚器内，打开全部侧室入口。允许试验大鼠自由探索10 min。用摄像机记录其运动轨迹，利用软件逐帧统计试验大鼠进入Stranger 1所在侧室以及空侧室的时长。

1.5.6 社交新奇测试 通过社交新奇测试检测Tph2基因敲除是否会导致大鼠的社会新奇认知能力发生变化，社交新奇测试采用三室试验设备，将试验大鼠引导到中央室，封锁两侧室的入口。将第2只陌生大鼠(Stranger 2)放置在另一侧室。允许试验大鼠自由探索三室10 min，用摄像机记录其运动轨迹，利用软件逐帧统计试验大鼠进入Stranger 1和Stranger 2所在侧室的时长和次数，探索新陌生鼠(Stranger 2)的时间越短表明大鼠的社会新奇认知能力越低。

1.6 数据分析与处理

使用软件GraphPad Prism 7进行分析和作图。使用 Kolmogorov-Smirnov normality test检测数据是否为正态分布。对于符合正态分布的数据，用Student’sttest对两组数据进行比较，用ANOVA对多组数据进行比较；对于不符合正态分布的数据，用Mann-Whitney test对两组数据进行比较。

2 结果与分析

2.1 Tph2KO大鼠的鉴定

PCK鉴定结果(图1)显示，WT大鼠扩增出611 bp的Tph2基因，Tph2KO大鼠扩增出385(即611-98-128=385)bp的条带，结果表明Tph2KO大鼠Tph2基因的第6外显子(98 bp)及其前128 bp序列被成功敲除。

M.DNA Marker；1～2.Tph2KO 大鼠；3.WT 大鼠

2.2 Tph2基因敲除对Tph2KO大鼠体质量和大脑中缝核5-HT含量的影响

10周龄时，WT大鼠的体质量为317.9 g/只，Tph2KO大鼠的体质量为235.9 g/只，极显著低于WT大鼠(P<0.01)，表明Tph2基因敲除会导致大鼠体质量下降。

标准液中5-HT浓度(x)与相应峰面积(y)的标准工作曲线为y=452 340+809 615x，相关系数R2为0.994 7，在0～1 000 nmol/μL内线性关系良好。

大鼠大脑中缝核 5-HT的含量如表1所示。由表1可知，WT雄大鼠大脑中缝核中5-HT含量为2 075.00 nmol/g，极显著高于空白对照组(0 nmol/g)和Tph2KO雄大鼠(19.08 nmol/g)(P<0.01)，空白对照组与Tph2KO组无显著差异(P>0.05)。这表明Tph2基因敲除会导致大鼠大脑中缝核5-HT含量显著降低。

表1 大鼠大脑中缝核 5-HT的含量

2.3 Tph2基因敲除对大鼠焦虑水平的影响

在旷场试验中，进入旷场中心区域的时间和次数越多表明大鼠的焦虑水平越低。旷场试验结果(图2)显示，与WT雄大鼠(探索中心区域的时间为38.76 s，次数为9.90次)相比，Tph2KO雄大鼠探索中心区域的时间(30.00 s)和次数(6.50次)虽然表现出降低的趋势，但无统计学差异(P>0.05)。

图2 Tph2基因敲除对大鼠探索旷场中心区域时间和次数的影响

高架十字迷宫试验结果(图3)显示，Tph2KO雄大鼠探索开放臂的时间(69.89 s)和次数(5.40次)与WT雄大鼠探索开放臂的时间(66.25 s)和次数(4.30次)均无显著差异(P>0.05)。

2.4 Tph2基因敲除对大鼠抑郁样行为的影响

强迫游泳试验结果显示，与WT雄大鼠静止漂浮的时间(27.79 s)相比，Tph2KO雄大鼠静止漂浮的时间(43.92 s)有升高的趋势，但未达到显著差异(P>0.05)。

2.5 Tph2基因敲除对大鼠社交能力的影响

Tph2基因敲除对大鼠位置偏好的影响如图4所示。

图4 Tph2基因敲除对大鼠位置偏好的影响

由图4可知，WT雄大鼠探索左(254.60 s)右(252.80 s)两侧室的时长和Tph2KO雄大鼠(左238.2 s，右217.3 s)无显著差异，未表现出明显的位置偏好。

Tph2基因敲除对大鼠社会互动的影响如图5所示。

图柱上标不同大写字母表示同组差异极显著(P<0.01)。图6同

由图5可知，WT雄鼠探索陌生大鼠1的时间(社会互动时间)为258.00 s，极显著大于探索空室的时间(26.34 s)(P<0.01)；Tph2KO雄大鼠社会互动时间(224.00 s)也极显著大于探索空室的时间(12.57 s)(P<0.01)，说明Tph2基因敲除不会影响大鼠的社交水平。

2.6 Tph2基因敲除对大鼠社会新奇认知能力的影响

社交新奇测试结果(图6和图7)显示，WT雄大鼠探索陌生大鼠2的时间(124.00 s)极显著大于探索陌生大鼠1的时间(69.88 s)(P<0.01)，而Tph2KO雄大鼠探索陌生大鼠2的时间(73.92 s)与探索陌生大鼠1的时间(59.71 s)无显著差异(P>0.05)，表明Tph2基因敲除导致大鼠的社会新奇认知能力降低。Tph2KO雄大鼠探索陌生大鼠2的次数(14次)与其探索陌生大鼠1的次数(12.4次)无显著差异，WT雄大鼠探索陌生大鼠2的次数(14次)也与其探索陌生大鼠1的次数(11.1次)无显著差异，表明Tph2KO雄大鼠社会新奇认知能力降低不是由于运动缺陷改变造成的。

图6 Tph2基因敲除对大鼠社会互动时间的影响

3 讨论与结论

Tph2是中枢神经系统5-HT合成的限速酶，特异性敲除大鼠Tph2基因后，大鼠大脑中缝核5-HT含量显著减少，这与小鼠中报道的结果[9]一致。

本研究显示，Tph2KO大鼠体质量显著低于野生大鼠，这与小鼠中报道的结果[10]一致。研究发现，与WT小鼠相比，Tph2KO小鼠的摄食量、脂肪质量显著减少，而能量消耗(耗氧量、总水平运动活动和产热量)增加[10]。研究证实，小鼠脑内的5-HT可通过5-HTR1a、5-HTR2b、5-HTR2c等受体来调节食欲和能量消耗[11-12]，因此，5-HT的缺失可能是导致Tph2KO大鼠体质量降低的主要原因。

本研究发现，与WT大鼠相比，Tph2KO大鼠在旷场中心区域的探索时间和次数有明显减少的趋势，但未达到统计上的显著差异，提示Tph2基因敲除可能会引起大鼠焦虑水平增加，这在Tph2KO小鼠上也有类似的报道[9]。有趣的是，5-HT再摄取转运体(serotonin transporter，SERT)基因缺失的啮齿动物因再摄取受损，中枢细胞外5-HT水平升高。SertKO小鼠[13-14]和大鼠[15]均表现出在旷场中心花费的时间减少等类似焦虑的症状和社交障碍[10]。此外，有研究将中缝核进行结构划分，认为中缝核存在平行子系统，这些子系统在神经投射、生理反应属性和行为功能上均存在差异[16]。条件敲除中缝核投射到眶额叶皮层的5-HT神经元会导致焦虑水平增加，而条件敲除中缝核投射到中央杏仁核的5-HT神经元会导致焦虑水平降低[16]。这种异质性的存在提示，需要通过对大脑中的5-HT神经元进行更精细的划分，才能更好地了解大脑5-HT系统与焦虑水平之间的关系。

三室行为测试可以用于测试啮齿动物的社交倾向。啮齿动物通常喜欢花更多的时间探索同类，这一现象称为社交性；同时还表现出与陌生同类互动的时间比与熟悉同类互动的时间长，称为社交新奇性。本研究发现，Tph2基因敲除对大鼠的基本社交能力无显著影响，但大鼠社会新奇性显著降低，这种缺陷似乎不是由于探索活动改变造成的，可能是由于普遍的认知功能障碍引起的[17]，因为Tph2KO大鼠进入两侧室的次数没有差异，SertKO大鼠的研究结果[15]也支持这一结论。有研究表明，人类大脑内侧前额叶皮层与认知记忆相关，而5-HT神经元向内侧前额叶皮层发出广泛投射，且5-HTR2a在内侧前额叶皮层中高度表达，与其功能相关[18]。人类发育过程中，5-HT受体表达的差异会影响前额叶皮质内相关神经回路的活动和建立，如果5-HT系统功能在发育关键时间窗口被破坏，将导致前额叶皮层5-HT神经元活动的改变，使得成年后的认知和情绪行为受损[19]，另外，Tph2KO大鼠对新事物恐惧的增加也可能导致社会认知能力降低[19-20]。

考虑到5-HT系统与抑郁症存在相关性[21-22]，本研究采用强迫游泳试验检测大鼠静止漂浮的时间。结果表明，与WT大鼠相比，Tph2KO大鼠未表现出明显的抑郁样行为，但静止漂浮时间有增加的趋势。与焦虑水平一样，抑郁样行为也受中缝核不同亚区的5-HT神经元调控[16]，研究发现条件敲除中缝核-眶额叶皮层的5-HT神经元会导致抑郁样行为增加，而条件敲除中缝核-中央杏仁核的5-HT神经元会导致抑郁样行为减少[16]。因此，5-HT神经元对抑郁样行为的调控还需进一步探究。

综上所述，Tph2基因敲除导致雄性大鼠大脑中缝核5-HT含量显著减少，大鼠体质量明显降低，焦虑水平有增加的趋势，社会新奇认知能力降低。