祝伟霞， 张守杰， 郁 露， 师子豪， 杨 娜

（郑州海关技术中心， 郑州 450003）

氨基酸是生物功能的主要载体，已发现300多种氨基酸，是环境、食品、生物、生命活动中重要的物质，国内外学者从不同角度、不同方面、不同领域对氨基酸进行研究分析。 目前氨基酸测定方法包括专用仪器分析法、光谱法、色谱法、质谱法、电泳法和生物法[1]。 生物样品基质复杂，氨基酸是蛋白质的构件分子，在进行测定前需要采用酸、碱和蛋白酶催化将蛋白质水解成α-氨基酸的混合物。 我国食品安全国家标准规定采用6 mol/LHCl溶液酸水解方法测定氨基酸，李梅等优化了酸水解不同实验条件[2]。 氨基酸属于高活性、强极性、难挥发性的一类化合物，在气相色谱分析时需要采用相应的衍生化技术改善其色谱行为。 本文主要介绍了采用气相色谱技术测定氨基酸的研究进展。

1 衍生化方法进展

衍生化反应是采用气相色谱测定游离氨基酸的主要步骤，氨基酸结构中存在氨基、羰基、羟基等多个极性基团，在中性溶液中以两性离子存在，不易挥发性，进行气相色谱分离时，极性基团与固定液产生氢键作用力，导致不出峰、峰形拖尾、灵敏度低等问题， 因此需将其衍生化成挥发性好且热稳定的衍生物后进行分析。 氨基酸衍生化可以在氨基和羧酸基团上进行，主要包括羟基硅烷化、羰基酯化和氨基酰化衍生技术。

硅烷化衍生反应是通过硅烷基与羧基、氨基、羟基中活泼氢反应生成相应的硅酯衍生物， 常用的硅烷化反应试剂包括三甲基硅烷( TMS)、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺( MSTFA)、N-O-双(三甲硅基)三氟乙酰胺( BSTFA)等试剂。 硅烷化反应产物稳定性强， 但硅烷化衍生物进行气相色谱氢火焰离子化检测器，长时间硅沉积易污染仪器，采用气相色谱稳定同位素质谱测定硅衍生物，降低燃烧炉的氧化效率，影响使用寿命。杨芹等采用MSTFA作为衍生化试剂，在全蝎中发现的16种游离氨基酸[3]。 酯化和酰化是两种重要的氨基酸衍生化技术， 氨基酸的羧基和其它有机酸的羰基一样， 在一定的条件下可以被醇酯化后，形成相应的酯类化合物。 当氨基酸的羧基变成甲酯、乙酯、丙酯、丁酯衍生物后，羧基的化学反应性能即被掩蔽，氨基的化学性能得到加强，更易于酰基或烃基结合。 酰化反应是在氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱性溶液中发生作用， 酰基取代氨基酸结构中的活性氢。 因氨基酸结构中多个极性基团，联合采用酯化和酰化是氨基酸分析最常用的衍生化方法，首先在相应的醇和盐酸条件下酯化， 然后在非挥发性中间体蒸发后的酰化。该过程可产生N-酰基（乙酰基、三氟乙酰基、五氟丙基、七氟丁基等）的各种酯（即甲基、乙基、异丙基、仲丁基、戊基、异戊基等）化合物，表1列出常用酯酰化方法。 刘海珍等测定鳗鱼肌肉组织16种氨基酸三氟酸异丙酯衍生物， 结果误差在0.1‰～0.5‰之间[4]。许庆琴采用七氟丁酸酐和酸性正丁醇作为13种氨基酸的衍生化试剂， 气相色谱氢火焰离子化检测法测定了野生果汁中氨基酸含量，回收率在84.4%～96.0%之间[5]。李红燕对比了氨基酸N-乙酰基正丙酯( NAP) 法和氨基酸N-三氟乙酰基异丙酯(TFAIP) 法测定17 种氨基酸衍生化效果,结果表明TFAIP测定偏差0.02‰～0.31‰，NAP0.04‰～0.67‰，证明TFAIP法结果更稳定[6]。 孟庆国对比了影响19种氨基酸衍生化反应的酯化时间、酯化温度、酰化时间和酰化温度等条件， 结果表明酰化反应时间越长，蛋氨酸衍生化产率越高，精氨酸和色氨酸产率下降，其它16种氨基酸温度和时间影响小[7]。

表1 氨基酸分析不同的衍生化方法

2 仪器测定方法研究进展

根据氨基酸衍生物的物理化学性质和应用领域，氨基酸的测定主要采用电子捕获检测器（ECD）、氢火焰离子化检测器(FID)、四极杆质谱技术(MS)和稳定同位素比质谱技术(IRMS)。 高灵敏度的电子捕获适用于增加卤素的亲电性衍生物。 FID对所有有机物产生信号响应， 信号强度与氨基酸衍生物的碳原子数成正比，在定量多种氨基酸含量方面应用广泛，但氨基酸结构中氮、 氧杂原子影响FID信号响应，FID定量测定时，需要校正因子。许德成等采用FID法测定20种蛋白质氨基酸，测果结果与氨基酸分析仪进行对比，结果表明FID法分析鱼松食品中氨基酸变异系数小于9.2%，氨基酸分析仪的变异系数小于8.2%[8]。

气相色谱质谱法可以同时满足定性和定量的需求， 张红漫等采用气相色谱一质谱法测定中药沙苑子中的氨基酸， 测定沙苑子中氨基酸的总质量分数为4.23%[9]。杨瑞琴等采用气相色谱-质谱联用法分析手印残留物中氨基酸的研究， 刑事科学技术手印显现部分的发展提供帮助[10]。 气相色谱同位素比质谱分析蛋白氨基酸的碳和氮元素， 可以溯源蛋白质的合成、降解和代谢，跟踪碳氮元素转化过程，对于生命科学和食品研究具有重要的意义。 钟其顶等采用气相色谱同位素质谱仪测定发酵液中游离氨基酸δ13C值，稳定碳同位素丰度的精度误差小于0.5‰[11]。何红波等采用气相色谱同位素质谱方法测定土壤氨基酸中氮同位素， 可有效区分土壤中原有的和利用外源氮素新合成的氨基化合物[12]。 孟靖等采用气相色谱同位素比值质谱法测定枸杞氨基酸中氮同位素比，测定结果δ15N值精密度为0.13‰～0.52‰，未产生同位素馏分效应[13]。

3 存在的问题

气相色谱测定氨基酸时存在的问题：首先，衍生化应时间长，需要多个步骤的溶剂转移，衍生操作费时。 其次，评价结果准确性难，氨基酸的反应产率对照氨基酸标准品进行计算，无法计算准确蛋白质-氨基酸-衍生物的反应产率。最后，气相色谱-质谱作为氨基酸的定性方法，应建立相应衍生物离子碎片、分子离子峰等NIST库，实现准确定性。