周学府，郑远荣，钟 宇，王丹凤，邓 云

（上海交通大学农业与生物学院 上海201100 乳业生物技术国家重点实验室 上海乳业生物工程技术研究中心 光明乳业股份有限公司乳业研究院 上海 200436）

酪蛋白（Casein）是牛乳中关键蛋白质之一，主要由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白组成。在牛乳中大多数酪蛋白呈胶束球形颗粒，约10%～20%以溶解或非胶束的形式存在[1]。作为一种全蛋白，酪蛋白具有较高的营养价值，并具有良好的功能特性，因而被广泛应用于食品工业[2]。

高密度二氧化碳（DPCD）是一种新型的非热加工技术，它通过在温度低于60 ℃，压强低于50 MPa 的条件下，利用CO2的分子效应实现杀菌和钝酶的目的，最大限度地保持食品感官和营养品质，延长其保质期[3]。DPCD 与传统热处理相比，具有能耗低，对食品品质影响较小等优势，被公认为食品工业具有发展前景的冷杀菌技术[4]。

据报道，DPCD 能够在杀灭微生物的同时，影响食品中蛋白质的结构及物理特性[4-5]，从而引起食品品质变化。研究表明[3，6]，DPCD 能使虾肌球蛋白二级结构中α-螺旋转化为β-折叠，并破坏肌球蛋白三级结构，与此同时也改变其溶解度、浊度、黏度等物理特性。目前关于DPCD 对乳制品特征蛋白结构、功能和品质的影响鲜有研究报道。本试验研究DPCD 处理前、后酪蛋白结构和物理特性的变化，探究其随压强、时间、温度改变的规律，为乳制品的加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料 酪蛋白酸钠（Casein Sodium，酪蛋白含量≥90%），Adamas 公司；Bradford 蛋白浓度测定试剂盒，上海皓嘉科技发展有限公司。

1.1.2 主要仪器 间歇式高密度二氧化碳装置（HKY-1），海安石油科研仪器有限公司；圆二色谱仪（J-815 spectrometer），日本分光公司；多功能酶标仪（M1000），瑞士帝肯公司；纳米粒度分析仪（Zetasizer Nano S），英国Malvern 公司；流变仪（Haake RS 6000），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；均质机（PT 10-35 GT），瑞士Kinematica 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酪蛋白酸钠溶液制备 称取0.5 g 酪蛋白酸钠溶解于50 mL 去离子水，室温下于磁力搅拌器上搅拌20 min，配制成质量浓度为10 mg/mL 的酪蛋白酸钠溶液。

1.2.2 间歇式DPCD 处理 首先打开循环水泵和冷箱，使处理釜温度升至设定值并使冷箱温度降至4 ℃左右。将50 mL 蛋白溶液平均分装于3 个离心管，并放置于DPCD 处理釜中。密封后打开真空泵抽取处理釜中多余气体，打开CO2总阀、进气阀以及加压泵，待处理釜中压强升至设定值后关闭阀门和加压泵（升压过程约持续7 min），样品在恒定温度和压强下保持一段时间。处理结束后打开放气阀缓慢泄压（泄压过程约持续3 min）。本研究针对压强、温度、时间3 种因素进行单因素重复试验，设计方案如下：

1）固定温度35 ℃，时间25 min，设置压力梯度为5，10，15，20，25，30 MPa；

2）固定温度35 ℃，压强15 MPa，设置时间梯度为5，15，25，35，45 min；

3）固定压强15 MPa，时间25 min，设置温度梯度为35，34，55，65 ℃，并以相同温度的单纯热处理作为对照。

1.2.3 圆二色谱分析 酪蛋白二级结构通过圆二色谱仪进行测定[7]。将蛋白样品用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH 7.4）稀释至0.1 mg/mL。在25 ℃条件下，使用光程长度为1 mm 的石英比色皿在190～260 nm 的波长范围内以100 nm/min 的速率扫描，每次扫描进行3 次重复。使用相同浓度磷酸盐缓冲液对所有测得的光谱进行基线校正。

1.2.4 表面疏水性（H0） 使用1-苯胺基-8-萘磺酸盐（ANS）测定酪蛋白的表面疏水性[8]，将每组蛋白样品用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH 7.4）稀释至5 个不同的质量浓度（0.05～0.2 mg/mL），将10 μL ANS（8 mmol/L）添加至4 mL 样品溶液中，静置3 min。用荧光光谱仪在390 nm（激发波长）和470 nm（发射波长）下进行测定。荧光强度随蛋白浓度变化的斜率即为相对表面疏水性，进行3 次重复。

1.2.5 溶解性 将酪蛋白样品于25 ℃、8 000 r/min 离心15 min，取上清液，通过Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定上清液可溶性蛋白含量。溶解度按以下公式计算：

1.2.6 动态光散射（DLS） 通过动态光散射测定蛋白样品的粒径，方法如下[10]：将蛋白样品用去离子水稀释至1 mg/mL，用纳米激光粒度仪测定酪蛋白的粒径，每组样品测定3 次取其平均值。

1.2.7 表观黏度 酪蛋白溶液的流变学特性通过流变仪评估[11]。通过流变仪测定酪蛋白溶液（10 mg/L） 表观黏度与剪切速率的函数关系，试验条件：平板间距：1 mm，温度：25 ℃，剪切速率范围：0.1～100 s-1。

1.2.8 乳化性 将6 mL 酪蛋白溶液 （10 mg/mL）和2 mL 玉米油混合，使用均质机以10 000 r/min转速均质1 min，从离心管底部吸取20 μL 新鲜配置的乳液，加入至5 mL 0.01 g/L SDS 溶液中，混合均匀，在500 nm 处测量吸光度，记为A0。乳液静置30 min 后，以相同的方法吸取乳液稀释于SDS溶液中，在500 nm 处测量吸光度，记为A30，以0.01 g/L SDS 溶液作为对照，试验进行3 次重复。酪蛋白的乳化活性（EAI）和乳化稳定性（ESI）计算公式如下：

式中：T=2.303；N——稀释倍数；C——乳状液形成前蛋白质水溶液中蛋白质的质量浓度，g/mL；Φ——乳状液中油相的体积分数。

1.2.9 数据处理 试验结果以平均值±标准偏差表示，并使用SPSS 16.0 软件进行分析。使用单因素方差分析（ANOVA）分析数据，并进行Duncan的多范围检验以确定平均值之间的差异。结果在P<0.05 时被认为有显著性差异，具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 二级结构

DPCD 对酪蛋白的二级结构影响如图1和表1所示。从图1看出，酪蛋白CD 光谱在波长为200 nm 附近均出现1 个明显的负峰，表明酪蛋白含有大量的无规则卷曲结构[12]，Kong 等[12]也发现类似的二级结构特征。经DPCD 处理后酪蛋白的CD 光谱信号强度显著降低，意味着处理对酪蛋白二级结构产生显著影响。表1显示了DPCD 处理前后酪蛋白的4 种二级结构含量，能看出酪蛋白二级结构绝大多数呈无规则卷曲，这与CD 光谱特征峰分析结果一致。DPCD 能够显著降低酪蛋白二级结构中α-螺旋含量（P<0.05），尤其在高压（30 MPa）和长时间（45 min）处理条件下其影响更为显著，其α-螺旋含量从8.15%分别降低至5.65%和5.95%。α-螺旋含量减少，表明维持酪蛋白结构稳定的氢键部分断裂，使得蛋白质处于伸展状态。但在温度较高处理条件下（55 ℃、65 ℃），酪蛋白α-螺旋含量分别上升至10.1%和8.6%，可能是因为高温和DPCD 的协同作用增强了酪蛋白分子相互作用，改变蛋白质氢键取向从而生成更多氢键。另外，35 ℃下DPCD 使酪蛋白中的β-折叠含量显著增大（P<0.05），无规则卷曲含量降低，说明其二级结构中α-螺旋和无规则卷曲存在向β-折叠转化的趋势。DPCD 导致蛋白质二级结构发生此类转变在其它蛋白质中也有所报道，例如虾肌球蛋白[6]和肌红蛋白[13]。

表1 DPCD 对酪蛋白二级结构各组分含量影响Table 1 The effect of DPCD treatment on second structure fractions of casein

（续表1）

2.2 表面疏水性（H0）

DPCD 对酪蛋白表面疏水性影响如图2所示。随着DPCD 处理压强增大以及温度升高，酪蛋白表面疏水性先升高后下降，分别在处理压强为20 MPa，温度为45 ℃条件下达到最大值（18.49 和22.16）。而在一定范围内，处理时间越长其表面疏水性越大。

图2 DPCD 对酪蛋白表面疏水性影响Fig.2 The effect of DPCD on the surface hydrophobicity of casein

总体而言，DPCD 能够显著增大酪蛋白的表面疏水性（P<0.05），暴露出埋藏于分子内部的疏水性基团，其归因于超临界CO2作为疏水性溶剂，能通过与蛋白质结构中疏水性基团反应，对蛋白质表面疏水性起修饰作用[14]。Ding 等[14]和Sheng等[15]的研究也存在相似结果，其研究表明，经DPCD 处理后的蛋清和全蛋液的表面疏水性显著上升。而在本研究中，高压（25，30 MPa）以及高温（55，65 ℃） 导致酪蛋白表面疏水性降低是因为高压和高温可导致疏水性基团相互结合而重新掩埋于蛋白质分子内部[6]。

2.3 物理特性

2.3.1 溶解度 DPCD 对酪蛋白溶解度影响如表2所示。与未处理的酪蛋白相比，经DPCD 处理后酪蛋白溶解度显著降低 （P<0.05）。其原因是CO2降低了体系pH 值及其对酪蛋白碱性氨基酸的修饰作用[16-17]。

由表2可知，随着处理压强增大以及处理时间延长，酪蛋白溶解度呈降低趋势，其归因于升压能增大CO2在水中的密度与溶解度以及长时间处理使CO2得以充分溶解与扩散，从而增强CO2分子效应。对于温度影响而言，单纯热处理未能影响酪蛋白溶解度，而高温条件（55，65 ℃）下DPCD 使其溶解度急剧下降，从93.98%分别降至38.62%和42.68%，这与酪蛋白二、三级结构的异常变化相关。溶解度作为酪蛋白重要的物理性质之一，与其它功能性质如乳化性、起泡性存在紧密联系[18]。因此考虑到DPCD 对酪蛋白溶解度影响，在相同杀菌效果前提下，选择较低的DPCD 处理压强、温度和较短处理时间对乳制品进行杀菌能减少酪蛋白的沉淀。

2.3.2 粒径 表2显示了DPCD 处理前后的平均粒径，可用于分析酪蛋白的分子链构象、聚集体尺寸及形态。由表2可知酪蛋白粒径随DPCD 处理压强升高和处理时间延长先减小后增大；温度方面，升高处理温度能够引起酪蛋白粒径突增，尤其在55 ℃处理温度下，其粒径突变至1 030.43 nm。

表2 DPCD 对酪蛋白物理性质的影响Table 2 The effect of DPCD treatment on physical properties of casein

以上结果表明，DPCD 对酪蛋白粒径的影响是处于使其解离和聚集的动态平衡中[19]，在高压（30 MPa）、长时间（45 min）以及较高温（45，55，65℃） 的处理条件下，DPCD 对酪蛋白聚集效应大于解离效应而引起其粒径增大，而其它条件下DPCD 对酪蛋白存在轻微解离效应。蛋白质的解离可能是因为DPCD 处理过程中，溶液中不仅存在酪蛋白间的相互作用，同时也存在CO2与蛋白质的相互作用，如疏水相互作用、氢键、静电作用[20]等，从而导致蛋白间的相互作用减弱而解离[19]。高温（55，65 ℃）下DPCD 诱导酪蛋白粒径的突变与二级结构、表面疏水性变化相符，再次印证高温和DPCD 存在一定协同作用，共同引起酪蛋白聚集沉淀。蛋白质粒径可影响其吸收率和食品感官品质[21]，蛋白较小粒径赋予食品细腻的口感和更高的消化吸收率。因此，DPCD 对乳制品杀菌过程中应避免较高的处理温度以及处理压强。

2.3.3 表观黏度 DPCD 处理前后的酪蛋白溶液的流动行为如图3所示。酪蛋白在剪切速率（0.01～1 s-1） 范围内表现出较强的假塑性行为，而在（1～100 s-1）范围内其表观黏度变化不显著，近似于牛顿流体。虽然DPCD 对酪蛋白结构具有破坏作用，但仍未改变其剪切稀化的流动行为。由图3可知，DPCD 显著降低酪蛋白的表观黏度，其原因一方面来自于较小的粒径导致酪蛋白体系流动性增强[22]。另一方面，蛋白质黏度与其溶解度存在一定关系[23]，只有同时具备高溶解度以及强吸水性才能产生高黏度体系。因此受DPCD 影响，酪蛋白溶解度降低使得酪蛋白与水的体系表观黏度下降，这也能解释高温处理条件下酪蛋白粒径增大但表观黏度降低的现象。范金波等[24]与Sheng 等[15]有相似的研究结果，全蛋液和蛋清液经DPCD 处理后黏度也显著降低。但由图3可知，相比于温度与时间因素对酪蛋白表观黏度影响，处理压强对其影响更为显著。当压强大于10 MPa 时，其表观黏度急剧降低。乳制品的黏度与感官品质之间存在相关关系[25]，过高或过低的黏度都不利于乳制品的加工，因此控制处理压强是维持乳制品黏度的有效手段。

图3 DPCD 对酪蛋白表观黏度的影响Fig.3 The effect of DPCD treatment on viscosity profile of casein

2.3.4 乳化性 DPCD 对酪蛋白乳化活性（EAI）乳化稳定性（ESI）影响如表2所示。乳化活性表征了乳剂形成过程中蛋白质在油水界面快速吸附的能力[26]，由表2可知，总体上DPCD 处理降低了酪蛋白的乳化活性，这一现象可通过溶解度和表面疏水性变化解释。蛋白质乳化活性与其溶解度相关，DPCD 处理后酪蛋白较差的溶解性使其吸附于油水界面的分子数量减少，从而限制其乳化活性[27]。另外DPCD 对酪蛋白表面疏水性的修饰作用使其本身亲水性/疏水性平衡被破坏，使酪蛋白在界面处的吸附能力降低，从而降低其乳化活性[28]。乳化稳定性方面，DPCD 导致酪蛋白乳化稳定性显著降低（P<0.05），可归因于由DPCD 引起的酪蛋白表观黏度的下降导致分子分散于油水界面的稳定性降低，不能有效阻止乳化液滴絮凝而使其乳化稳定性下降。但随着压强升高和处理时间延长，其乳化性存在轻微上升趋势，这可能与酪蛋白溶液浊度变化有关。由此可见，DPCD 对酪蛋白乳化活性和乳化稳定性存在不利影响，一定程度上影响了酪蛋白的加工特性。

3 结论

DPCD 通过影响酪蛋白二、三级结构来改变其物理特性，从而影响乳制品品质。35 ℃条件下DPCD 将酪蛋白二级结构中α-螺旋和无规则卷曲结构转化为β-折叠，并增大其表面疏水性。但高温与DPCD 的协同作用可引起酪蛋白二、三级结构相反的变化。基于其对酪蛋白结构影响，35℃条件下DPCD 可降低酪蛋白溶解度并且能对蛋白分子起轻微解离作用，但高温处理条件下酪蛋白溶解度降低趋势更明显且更容易发生聚集而发生粒径的突变。而DPCD 对酪蛋白流动行为和界面特性影响表现在其引起酪蛋白表观黏度和乳化性的降低。总而言之，高温可增强酪蛋白对DPCD 的敏感性而使其品质更容易被破坏，因此用DPCD 对乳制品进行杀菌时低温（35 ℃）处理能有效维持酪蛋白的物理特性。然而，在实际生产过程中，还需和DPCD 的杀菌效果以及能耗相结合，实现在充分杀菌的同时，最低限度地影响乳制品品质。