吴任之， 张 翼， 刘 柳， 韩国全， 舒佳新， 易 艳， 苏奥兴， 马 毅， 罗毅敏

(四川农业大学食品学院 食品加工与安全研究所，四川 雅安 625014)

我国是猪肉生产和消费大国，猪肉占国内肉类消费总量的60%以上。国内外研究表明，市售生鲜猪肉在加工、储运及销售等环节，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的检出率较高，且常年均有检出，这主要与生猪的鼻腔、皮肤、屠宰环境和销售人员及环境中的金黄色葡萄球菌有关[1-2]。金黄色葡萄球菌是引起重大公共卫生问题的人畜共患病原微生物，能感染皮肤、软组织等几乎所有人体组织[3-4]。在中国20%～25%的细菌性食物中毒事件是由金黄色葡萄球菌引起的，实际暴发的食品中毒事件远比报道的多，其导致的食物中毒、组织感染与其产生的多种毒素和侵袭性酶有关；与金黄色葡萄球菌相关的食物中毒事件中，超过90%是由传统肠毒素(sea～see)引起的[5]。tst基因编码的中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)是金黄色葡萄球菌超抗原(SAgs)的重要成员，其广泛存在于动物、人和食物中，可引起人体发热、多器官系统功能紊乱及中毒性休克症状，不同耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分离株产生的TSST-1的量相差约170倍[6]。杀白细胞毒素基因(PVL)是导致社区相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)毒力增加的主要因素之一，CA-MRSA相较于家畜相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(LA-MRSA)携带lukSF-PVL基因更多，该基因主要引起炎症反应，如肺炎。溶血素基因分为 α、β、γ、δ四种类型，携带溶血素基因的菌株致病性更强，其中α溶血素对人的致病性最强，但溶血素基因型与其表型间的相关性存在较大争议。生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的污染状况已成为全球范围内的公共卫生问题，甲氧西林敏感菌株(MSSA)通过具有移动能力的基因元件转变为MRSA株，从而增加其耐药谱；非洲、美洲、东地中海等6个区域中，25%～90%金黄色葡萄球菌感染对甲氧西林具有较高耐药性，使用标准抗生素对以上MRSA菌株引起的疾病进行治疗均无效。MRSA的耐药性和致病性较强，血流感染患者病死率高达37.10%，显著高于MSSA 13.51%的致病率。鉴于金黄色葡萄球菌在生鲜猪肉中的高污染率和致病性，本研究就雅安市雨城区市售生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的污染状况进行研究，并对分离株的耐药特征、毒力基因和agr分型进行较为全面的探究，为该地生鲜猪肉安全控制和检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 试验用73株金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，均由四川农业大学食品学院微生物团队实验室从采集的生鲜猪肉样本中分离并保存。标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 培养基 甘露醇高盐琼脂、MH琼脂、脑心浸出液肉汤、胰酪大豆胨肉汤培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；Baird-Parker平板；血平板。

1.1.3 试剂与仪器 细菌基因组DNA提取试剂盒DP302(北京天根生化科技有限公司)，聚合酶链式反应用2×TaqMaster Mix、DL2000 DNA Marker、引物(北京擎科生物科技有限公司)；血浆凝固酶；药敏实验用16种抗生素：克林霉素(CM)、阿米卡星(AN)、四环素(TE)、庆大霉素(GM)、呋喃妥因(FT)、红霉素(E)、氧氟沙星(OFL)、头孢噻肟(CTX)、磺胺甲噁唑(SXT)、氯霉素(C)、青霉素(P)、利福平(RA)、卡那霉素(K)、替考拉宁(TKL)、头孢西丁(FOX)、环丙沙星(CIP)(北京天坛生物制品股份有限公司)。梯度PCR仪(T100，美国伯乐公司)、凝胶成像分析仪(GELDOCXR+，美国伯乐公司)；超净工作台(SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司)；台式高速离心机(TGL-20M，湘仪离心机仪器有限公司)；高压灭菌锅(GI54DW，致微-厦门仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 2020年夏季和冬季在雅安市雨城区超市、农贸市场，使用无菌剪刀、镊子从生鲜猪肉表面采集25～50 g样本于无菌采样袋中，冷藏条件下4 h内送至实验室，再将样品剪碎后称取25 g备用；样本共计351份。

1.2.2 金黄色葡萄球菌的分离与鉴定 参照GB 4789.10-2016《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》第一法并做改进。称取25 g样本放入盛有225 mL 7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中拍击2 min。将上述均质液36 ℃培养24 h，划线于甘露醇高盐琼脂平板36 ℃培养24 h。挑取典型单菌落在Baird-Parker平板上纯化培养，将纯化后的菌株划线接种于血平板观察溶血圈，通过血浆凝固酶试管凝集试验和PCR扩增金黄色葡萄球菌特异性基因nuc进行鉴定[7]。参照细菌DNA提取试剂盒说明，对金黄色葡萄球菌基因组进行提取，DNA提取物于-18 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 金黄色葡萄球菌药敏试验及MRSA菌株鉴定 采用纸片扩散法(K-B法)对73株金黄色葡萄球菌进行16种抗生素的药敏试验，依据CLSI M100抗微生物药物敏感性试验执行标准2019版将试验用金黄色葡萄球菌分为耐受(R)、中介(I)、敏感(S)；将头孢西丁抑菌圈≤21 mm的菌株进行mecA基因扩增；药敏试验质控菌株为ATCC 25923。

1.2.4 金黄色葡萄球菌毒力基因扩增 通过PCR试验扩增金黄色葡萄球菌的传统肠毒素基因(sea～see)、中毒休克综合征毒素基因(TSST-1)、杀白细胞毒素基因(PVL)、溶血素基因(hla、hlb、hld)、脱皮毒素基因(eta、etb、etd)[8-9]；PCR反应体系为25 μL：12.5 μL 2×TaqMaster Mix，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，灭菌水8.5 μL；PCR引物序列见表1。

表1 PCR扩增引物序列及退火温度

1.2.5 金黄色葡萄球菌agr分型 根据特异性agr等位基因，利用多重PCR技术对73株金黄色葡萄球菌进行agr分型[8]，将其分为agrⅠ、agrⅡ、agrⅢ和agrⅣ型，由北京擎科生物科技有限公司完成测序。

2 结果与分析

2.1 生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的检出率及nuc基因鉴定结果

夏季从雨城区采集新鲜猪肉样本229份，包括常温鲜猪肉203份，冷藏肉丝(糜)26份，金黄色葡萄球菌总检出率为15.28%。常温样本阳性检出率为16.75%(34份)，分离出35株金黄色葡萄球菌；冷藏肉丝阳性检出率为3.85%(1份)，分离出2株金黄色葡萄球菌。冬季采集样本122份，包括常温鲜猪肉92份，冷藏肉丝(糜)30份；总检出率为28.69%，其中常温样本阳性检出率为38.04%(35份)，分离出36株金黄色葡萄球菌，冷藏肉丝未检出。经血浆凝固酶试管凝集试验和nuc基因鉴定，73株分离株均为金黄色葡萄球菌(图1)。

根据不同季节对样本进行分析，夏、冬季市售生鲜猪肉中均有金黄色葡萄球菌检出，但冬季常温样本中金黄色葡萄球菌的检出率高于夏季样本，这与孟含等[10]对成都市农贸市场生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的分离结果一致，其原因可能与生猪的生产屠宰和采样各环节有关。从样品销售温度分析，夏、冬季常温样本中金黄色葡萄球菌的检出率明显高于冷藏样本，主要原因是样本加工成肉丝(糜)前经过多次清洗，使样本中金黄色葡萄球菌的数量明显降低，加之销售温度较低，不利于金黄色葡萄球菌的繁殖，最终导致冷藏样本的检出率低于常温样本。

图1 不同季节生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的检出率Fig.1 Detection rate of S.aureus in fresh pork in different seasons

2.2 金黄色葡萄球菌耐药试验结果

73株金黄色葡萄球菌对16种抗生素的耐药性如表2、表3所示。结果显示，73株金黄色葡萄球菌对青霉素的耐受率最高(93.15%)，对四环素、红霉素、可林霉素、环丙沙星、氧氟沙星、头孢噻肟、卡那霉素的耐受率较高(45.20%、42.46%、28.77%、27.40%、26.03%、21.92%、21.92%)，对氯霉素、磺胺甲噁唑、利福平、呋喃妥因、替考拉宁的耐受率较低(15.07%、15.07%、12.33%、12.33%、10.96%)，对头孢西丁、阿米卡星、庆大霉素的耐受率最低(6.85%、5.48%、2.74%)。5株对头孢西丁耐受的金黄色葡萄球菌均扩增出mecA基因，将其鉴定为MRSA菌株。

表2 生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的耐药情况

表3 生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的多重耐药谱

从金黄色葡萄球菌的多重耐药谱分析，73株菌中有70株耐受至少1种抗生素(95.89%)；45株菌耐受至少2种抗生素(61.64%)，其中，8株为2重耐药(10.96%)，3株为3重耐药(4.11%)，6株为4重耐药(8.22%)，5株为5重耐药(6.85%)，8株为6重耐药(10.96%)，5株为7重耐药(6.85%)，4株为9重耐药(5.48%)，3株为10重耐药(4.11%)，2株为11重耐药(2.74%)，1株MRSA为13重耐药(1.37%)；有3株菌对所有抗生素敏感(4.11%)。本研究从生鲜猪肉中分离的金黄色葡萄球菌耐药谱较多，说明金黄色葡萄球菌在环境中长期受多种抗生素的胁迫，进化出对多种抗生素的耐受。值得注意的是，本研究中的5株MRSA菌株虽均为多重耐药株，但部分MRSA株的耐药谱少于MSSA株。

2.3 金黄色葡萄球菌毒力基因检测结果

对13种毒力基因进行PCR扩增，结果如表4、表5所示，73株菌共检出sea～sed四种传统肠毒素(80%)，see未检出；sea～sed在73株菌中的总检出率分别为4.11%(3/73)、12.33%(9/73)、12.33(9/73)、4.11%(3/73)。从不同季节分析，有5株菌分别检出sea和sed，冬季样本中分离出3株，其中1株菌同时含有sea和sed，夏季样本中分离出2株，分别含有sea和sed；冬季分离株占比大于夏季分离株。值得注意的是，seb和sec分别在9株菌中被检测出，8株夏季株中含seb(21.62%，8/37)，冬季菌株仅有1株(2.78%，1/36)；但冬季菌株中有8株含sec(22.22%，8/36)，夏季菌株只有1株(2.70%，1/37)；seb以夏季分离株为主，sec以冬季分离株为主。

中毒休克综合征毒素基因(TSST-1)总检出率为15.07%(11/73)，夏季8.11%(3/37)，冬季22.22%(8/36)。杀白细胞毒素基因(lukS/F)仅冬季检出1株(2.78%，1/36)。溶血毒素基因hla总检出率43.84%(32/73)，夏季35.14%(13/37)，冬季52.78%(19/36)；hlb总检出率为76.71%(56/73)，夏季83.78%(31/37)，冬季69.44%(25/36)；hld的总检出率为87.67%(64/73)，夏季91.89%(34/37)，冬季83.33%(30/36)。脱皮毒素基因中，eta仅在冬季分离中检出1株(2.78%，1/36)，etd检出3株(4.11%，3/73)，值得注意的是，除1株菌来自冬季样本外，其余2株均来自夏季冷藏肉丝；etb未检出。总体上，传统肠毒素中seb、sec的检出率较高，溶血毒素的检出率均较高，hld最高，脱皮毒素中etd检出率最高。

从73株菌携带的多重毒力基因分析，共61株菌携带≥2种毒力基因(83.56%)，24株菌携带2种毒力基因(32.88%)，18株菌携带3种毒力基因(24.66%)，11株菌携带4种毒力基因(15.07%)，7株菌携带5种毒力基因(9.59%)，1株菌携带6种毒力基因(1.37%)。5株MRSA菌株均检出多种毒力基因。

表4 金黄色葡萄球菌毒力基因鉴定结果

表5 金黄色葡萄球菌多重毒力基因型(≥2)的检测结果

2.4 金黄色葡萄球菌agr分型

对73株金黄色葡萄球菌进行分型，agrⅠ 37株(50.68%)，agrⅡ 7株(9.59%)，agrⅢ 13株(17.81%)，未检测出agrⅣ，16株菌未分型(21.92%)。其中，5株MRSA菌株分型为agrⅠ 3株(60.00%)，agrⅡ 2株(40.00%)，见图2。

图2 金黄色葡萄球菌agr分型结果Fig.2 Agr typing results of S.aureus

3 讨 论

金黄色葡萄球菌是常见的致病菌，能产生多种致病性毒素和侵袭性酶，对儿童、创口、软组织等威胁最大，特别是菌血症相关的死亡率高达37%；由金黄色葡萄球菌及其毒素引起的食物中毒事件的发生率也在前四位左右[11]。国内外研究表明，市售生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌始终维持在较高水平，由于MRSA在猪肉生产链各个环节之间的传播，猪肉可能成为金黄色葡萄球菌从农场传播到普通人群的媒介[1，12-13]。

本研究在夏、冬季从超市、农贸市场采集351份样本，总体分离率为19.94%，夏季和冬季样本的分离率分别为15.28%和28.69%，常温样本的分离率高于冷藏样本；该分离率比国外从供应链(76.67%)和零售店(33.9%)中采集的样本分离率低[13-14]，与国内陶晓亚等[15]、宋方宇[16]的研究结果接近；通过查阅相关文献发现，国内外生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的分离率从不到10%至接近80%均有报道，原因除生猪自身携带、屠宰、销售环节以及销售人员造成的污染外，最重要的差异出现在分离培养基的选择、样品的采集以及猪肉制糜工艺；Abolghait等[17]发现B-P琼脂是中等选择性的培养基，有误判、漏检的可能，不利于金黄色葡萄球菌的快速分离；在实验中也发现少部分金黄色葡萄球菌在B-P琼脂培养基上不典型；采样时不遵守无菌采样程序极易造成交叉污染，增加阳性检出率；通过走访多家生鲜肉糜售卖点发现，猪肉加工成肉糜之前经过数次流动水清洗，样品中初始活菌数和售卖温度较低，导致本研究肉糜中金黄色葡萄球菌的检出率低于常温猪肉。

药敏结果分析，73株金黄色葡萄球菌对青霉素(93.15%)、四环素(45.20%)、红霉素(42.46%)的耐受率最高，对头孢西丁(6.85%)、阿米卡星(5.48%)、庆大霉素(2.74%)的耐受率最低；这与张行等[18]的研究一致，与潘虎等[19]的研究有一定差异，这可能与菌株的来源及不同地区动物疾病治疗与预防方案有关。值得注意的是，本研究分离的菌株存在多种耐药谱，这与杨小庆[20]的研究一致，提示临床治疗时应先进行药敏试验，选择有效的抗生素，同时规范养猪行业抗生素的使用。5株对头孢西丁耐受的菌株经PCR扩增mecA基因证实均为MRSA株，MRSA是获得mecA基因的金黄色葡萄球菌，其mecA基因编码青霉素结合蛋白(PBP2a)，介导对甲氧西林及其他β-内酰胺类抗生素的耐药性，能在牲畜中定殖并对人类造成感染风险。本研究中MRSA菌株的检出率为1.42%，5株MRSA菌株均为多重耐药株，应引起注意。

金黄色葡萄球菌产生多种毒素和侵袭性酶，超过90%的由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件与金黄色葡萄球菌产生的传统肠毒素有关[21]。本研究表明传统肠毒素中seb和sec的检出率最高，邹忠爱[22]和沈玄艺等[23]发现食品中金黄色葡萄球菌肠毒素以seb为主，但检出率与本研究不同；宋明辉等[24]发现生鲜肉中金黄色葡萄球菌sec的检出率为12.55%，与本研究的12.33%基本一致，但未检出seb；说明不同地区、不同来源的金黄色葡萄球菌携带的肠毒素差异很大。中毒休克综合征毒素-1的检出率为15.07%，比李兵兵等[25]的检出率高。CA-MRSA克隆群通常携带PVL基因，本研究检出率为1.37%，张阳[26]的研究中未检出PVL基因，但Wang等[8]的检出率为93.8%，发现不同农场来源菌株的检出率明显不同，出现这种差异可能与菌株来源有一定关系。脱皮毒素是由噬菌体Ⅱ型金黄色葡萄球菌分泌的一种外毒素，由ETA、ETB和ETD三个亚型组成，ETA和ETB的研究较多，致病能力也最强，本研究中eta、etd基因的检出率为1.37%和4.11%，etb未检出。溶血毒素基因中，hla基因的检出率低于hlb和hld，部分菌株能同时携带三种溶血毒素基因，不同季节分离株中三种毒力基因检出差异不大。

目前，关于生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的agr分型研究较少，本研究中以agrⅠ为主(50.68%)，这与国内部分研究结果一致[18,26]。但Zhang等[27]和王琼等[28]的研究表明agrⅡ的检出率高于agrⅠ；原因可能与分离样本以及样本的地域性有一定关系。agrⅣ的检出率在0.4%～3.7%之间，常检测不出该分型，本研究中也未检出。值得注意的是本研究有16株菌未分型(21.92%)，因此对金黄色葡萄球菌的分型还应与MLST技术或其他分型技术相结合，才能为金黄色葡萄球菌的流行性提供更全面的数据。5株MRSA株分别属于agrⅠ和agrⅡ，但由于agr系统较为复杂，常与其耐药性、致病性、被膜形成能力有一定关系，因此agrⅠ和agrⅡ型是如何导致这5株菌产生超级耐药性还需要进一步研究。