在线固相萃取-液质联用法同时检测血液样品中12种芬太尼类药物

2022-04-11孙立敏王松才朱焕慧林贤文

刑事技术 2022年2期

孙立敏，王松才，朱焕慧，林贤文，管旭，谭莉

（广州市刑事科学技术研究所，广州 510030）

近年来，芬太尼类新型毒品作为一类新精神活性物质在全世界范围内有滥用趋势，尤其在欧美国家[1]。芬太尼类新型毒品属阿片类镇痛药物，其镇痛作用与吗啡类似，但镇痛效果比吗啡强几百上千倍，甚至上万倍[2]，滥用后会出现吸毒快感、呼吸抑制、心动过缓等副作用，少量服食即可致人死亡。查阅文献，对芬太尼类的检测，主要集中在血液、尿液、毛发、唾液、呼气、废水、芬太尼固体粉末[2]、芬太尼制毒原料[3]等样品中；常见的样品前处理方法主要有固相萃取法（SPE）、液-液萃取法[4]等，其中SPE法是生物样品中芬太尼类物质提取和富集最常用的前处理方法[2]；常见的分析检测技术主要为分光光度法、免疫分析法、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（UPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）等[2]，其中LC-MS联用技术多采用多反应监测模式，具有灵敏度高、重现性好的特点[5]。近年来，随着分析仪器的不断发展与改进，在线SPE与LC-MS联用已发展成比较成熟的一项分析技术，该技术通过六通阀将SPE柱与LC-MS联接起来，从而实现样品处理和样品分析的一体化[6]，可以大大简化操作。当前，关于色谱-质谱[7-8]、固相萃取-色谱-质谱联用[9]技术检测芬太尼均有报道，但是关于在线固相萃取-液质联用技术检测生物检材中芬太尼的报道较少。

本文建立了血液样品中12种芬太尼类药物的在线固相萃取技术与液质联用相结合的快速检测方法，具有操作简单方便、灵敏度高、样品量少、检出限低等特点，适用于血液样品中芬太尼类药物的检测分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1290-6470超高效液相色谱仪-三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent公司），在线固相萃取模块（美国Agilent公司），Milli-Q IQ 7003超纯水仪（美国Millipore公司），离心机3-18K（德国Sigma公司）。

芬太尼、对氟芬太尼、舒芬太尼、乙酰芬太尼、戊酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、丁酰芬太尼、异丁酰芬太尼、4-氟丁酰芬太尼、4-氟异丁酰芬太尼、卡芬太尼（纯度99.5%，公安部第三研究所）；乙腈、甲醇、甲酸、醋酸铵（色谱纯，美国Fisher公司）。

1.2 标准溶液制备

准确称取上述12种标准物质，用甲醇溶解配制成1 mg/mL的单标储备液，使用前根据需要用甲醇稀释配制成所需浓度混标溶液。

1.3 在线SPE和液相色谱条件

在线 SPE 柱：Agilent PLRP-S (15～20 μm，2.1 mm×12.5 mm)，在线SPE泵为Agilent 1260四元泵，流动相A为5%甲醇水，B为乙腈。分析柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm×2.7 μm），分析泵为Agilent 1290二元泵，流动相A为5 mmol/L醋酸铵缓冲液（含0.1%甲酸），B为乙腈。柱温40 ℃，进样量20 μL。六通阀切换、梯度上样及洗脱程序见表1，In-connection SPE-LC-MS/MS流路见图1。

表1 梯度上样及洗脱、六通阀切换程序Table 1 Programs for gradient sampling, elution and valve swithching

In-connection SPE-LC-MS/MS流路：上样阶段，SPE阀1-2位相通，检材样本经由自动进样器由SPE泵（四元泵）推入SPE柱，样品进入SPE柱后，在SPE柱上富集，同时利用SPE流路流动相对富集SPE柱上盐分及水溶性物质等进行清洗，完成样品上样，该阶段SPE流路液体流入废液，二元泵流路液体过色谱分析柱平衡。洗脱阶段，SPE阀3 min时瞬间切换至1-6位相通，SPE柱切入由二元泵、色谱分析柱、质谱组成的洗脱分析流路，待测组分由二元泵所推送流动相从SPE柱上洗脱至色谱柱分离最后进入质谱进行检测，待测组分在SPE柱上全部洗脱后，10 min时SPE再切换至1-2位相通，通过SPE四元泵推送高有机相（可自主选择）对SPE柱进行进一步洗杂活化，以备再次使用。

1.4 质谱条件

电喷雾正离子模式（ESI+），多反应监测扫描模式（MRM）；毛细管电压3 500 V，喷嘴电压：500 V，鞘气温度350 ℃，鞘气流量11 L/min，干燥气300 ℃，干燥气流量5 L/min。12种芬太尼类药物质谱参数见表2。

表2 12种芬太尼类药物质谱参数Table 2 MS parameters of 12 fentanyl-kind drugs

1.5 样品处理

取血液0.1 mL置于15 mL离心管中，加入0.4 mL乙腈沉淀蛋白，涡旋高速离心，取上清液用纯水1∶1对等稀释，用0.45 μm滤膜过滤备检。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

图2显示12种芬太尼类药物的TIC色谱图。

在12种芬太尼类化合物中4-氟丁酰芬太尼、4-氟异丁酰芬太尼以及丁酰芬太尼、异丁酰芬太尼分别互为同分异构体，结构相似，色谱保留性能相差不大，色谱峰出峰时间集中，难以完全分离，通过对不同类型色谱柱优化实验，最后选择了Poroshell 120 ECC18分析柱，实现了几种同分异构体的较好分离。从系统压力、分离效果、灵敏度等角度考虑，本方法在甲醇、乙腈中间选择乙腈作为流动相。

目标物结构基团能吸收电子，流动相中加入甲酸可以适当提高离子化效率，实验结果表明使用5 mmol/L醋酸铵缓冲液（含0.1%甲酸）、乙腈作为色谱分析流动相，可以实现几种同分异构体较好的色谱分离。

2.2 质谱条件优化

分别使用单标溶液，选择ESI+电离模式，利用仪器自带Optimizer自动优化软件对12种芬太尼类药物的母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能量等质谱参数进行确定优化，选择强度最高的两对离子作为定性分析离子，选择强度最强的离子作为定量离子，质谱主要参数见表2，MRM见图3。

2.3 在线SPE上样流速影响

空白血中添加12种芬太尼类药物混标，按1.5样品处理方法得到待测样品溶液，SPE泵上样流速分别为0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min，考察各流速条件下各组分SPE萃取回收率，结果显示12种芬太尼类药物在上述各流速条件下各待测组分回收率差别不大，综合考虑后端色谱峰形、洗杂效果等因素，本实验SPE上样流速选择1.0 mL/min。

2.4 在线SPE流动相选择

考察100%纯水、水（含0.1%甲酸）、95%水（含0.1%甲酸）+5%乙腈、95%水+5%甲醇4种SPE上样流动相对萃取率的影响。实验结果表明，12种芬太尼类物质在SPE柱上保留效果较好，4种流动相下各组分萃取率差别不大。考虑到样品洗杂效果、回收率等因素，上样SPE流动相选择95%水+5%甲醇。

2.5 在线SPE六通阀切换时间影响

空白血加入乙腈（体积比为1∶4）沉淀蛋白后进样，1.5 min后基线回落走平，所以洗杂去除盐分、水溶性的蛋白等物质至少需要1.5 min，六通阀上样时间T1至少要大于1.5 min。12种芬太尼类药物混标进样，上样时间分别设1、2、3、4、6、8 min，考察各组分SPE萃取率，结果各组分回收率无明显影响。综合考虑方法洗杂效果、待测组分回收率、检测时间，本方法六通阀切换时间选择T1=3 min。

选择T1=3 min，SPE柱切入分析柱流路中（阀切换）后再切换回SPE流路时间分别设：10、15、20、25 min，考察各组分萃取率。待测组分萃取率在上述4个时间条件下无明显差异，即SPE柱切入分析柱流路中7 min后12种待测组分基本上都可以从SPE柱转移至分析柱上。此时SPE柱及时切回四元泵回路，用高有机相冲洗洗杂，活化SPE柱，同时避免杂质等污染物进入分析柱及质谱中，所以SPE柱通过六通阀再次切回SPE流路时间点选择10 min。

2.6 在线SPE样品中有机溶剂比例影响

实验发现纯有机溶剂标样直接进样，溶剂效应明显，峰形变宽，部分组分峰重叠，过在线SPE柱后进样峰形有改善，但部分峰分离度较差。水样标准品直接进样、过SPE进样，峰形正常。100%乙腈标样过SPE进样5 μL，峰形勉强可用；50%乙腈过SPE进样10 μL，峰形尚可；40%乙腈样品过SPE进样20 μL，峰形分离度正常（图4）。综合考虑方法检测限、色谱分离、实际样品等因素，确定实际案件检验样品的处理为乙腈∶血=8∶2沉淀蛋白，上清液用水相1∶1对等稀释后过SPE进样分析。