刘冰 钱珊珊 李亚楠 顾敏 白植昊

摘要：目的：基于荧光定量免疫层析技术，基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteninase-9，MMP-9）定量检测试剂盒。[方法]采用双抗体夹心法，检测人血中的MMP-9活性水平。[结果]该方法的灵敏度为4.0 ng/mL，线性范围为5.0〜500 ng/mL，批内变异系数为9.94%〜15.39%，批间变异系数为11.0%〜16.6%，相对偏差小于10%， 测试结果显示该试剂相关系数r>0.98，具有好的相关性。[结论]建立一种操作简便，灵敏度高，有良好准确性和重复性，线性范围较宽，满足临床检验需求的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒。

关键词：基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteninase-9，MMP-9）;荧光免疫层析技术;试剂盒

MMP-9，属于基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，是人体内最重要的蛋白酶之一。其活性水平与多种心血管疾病诊断、慢性阻塞性肺疾病、恶性肿瘤、食管癌、胃癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌等预后判断等有明确相关性。可以通过血液MMP-9活性水平评估以上类疾病发生概率及恶化程度，在疾病发展中起到重要的作用[1-3]。

1材料与方法

1.1仪器和试剂

1）主要原材料：MMP-9包被用单克隆抗体，北新化成生物科技有限公司;MMP-9标记用单克隆抗体，北京万域美澜生物科技有限公司;羊抗鼠IgG，洛阳市佰泰科生物技术有限公司;时间分辨荧光微球，Bangs Lab公司;MMP-9纯化抗原，桂林英美特生物技术有限公司;NC膜，型号HF135，美国Milipore公司;其它化学试剂为分析纯或者化学纯。2）三维平面点膜喷金仪，上海金标生物科技有限公司;荧光免疫分析仪，为广州蓝勃生物科技有限公司提供。3）临床样本：佛山市顺德区北涪医院提供。

1.2方法

1.2.1时间分辨荧光抗体结合垫制备

将时间分辨荧光微球取出置于离心管中，离心（18000 rpm ） 60min，弃上清，加入0.05 M MES （pH 6.0 ）清洗两遍。加入EDC/NHS与室温震荡活化4h后，离心（18000 rpm ） 60 min，加入0.01 M PB （ pH 7.0 ）将微球重悬，按1mg微球标记0.2 mg抗体的比例加入相应抗体。室温震荡偶联反应2h，加入0.5%的BSA室温震荡封闭2h后，开始离心（10000 rpm ） 60 min， 弃上清，加入含0.5%BSA的0.01 MPBS，2〜8 °C保存备用。将标记好的抗体 稀释成0.5 mg/mL，使用三维平面点膜喷金仪喷膜到 结合垫（4ul/cm）上，37Y干燥5h，制成时间分辨荧光抗体结合垫，于湿度为RH30%〜40%的环境下保存备用。

1.2.2包被抗体NC膜制备

用含0.5%乙醇胺的0.01 M PBS将MMP-9包被抗体配成0.5mg/mL，然后使用三维平面点膜喷金仪将其按1-5ul/cm进行包被，同时包被1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，将NC膜于37Y干燥5h，于湿度为RH30%〜40%的环境下保存备用。

1.2.3试剂卡组装

将准备好的吸水纸、样品垫、PVC底板、试剂卡壳等包装材料在湿度为RH30%〜40%的环境下进行组装，并切成小条（宽3.8mm/条），将试剂条装入试剂卡壳中，井压壳制成检测的试剂卡。放入铝箔袋中，加入干燥剂，密封后与2〜8Y保存备用。

1.2.4内置标准曲线制备

将MMP-9使用QuikRead go检测系统进行定标，并经MMP-9国际校准物质进行校准后，配置成5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、300.0、500ng/mL的内部校准品，用制备好的试剂卡检测，利用时间分辨荧光免疫分析仪进行判读，记录检测的信号。将浓度与检测信号按最小二乘法进行拟合曲线，再将拟合好的曲线参数录入到时间分辨荧光免疫分析仪中，成为内置标准曲线。

1.2.5样本检测

取10uL全血或者5uL血浆样本，加入到2mL的样品稀释液中，充分混匀后，取80ul混合液滴入到试剂卡样品孔中，室温下反应5min后，用时间分辨荧光免疫分析仪判读结果。

1.2.6性能评估

分别使用MMP-9内部校准品、含干扰物的样品等对试剂卡进行检测，按照《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则（征求意见稿）》评估检测系统的分析灵敏度、线性 范围、精密度、准确度、特异性及其稳定性。

1.2.7统计学方法

检测数据使用SPSS17.0等统计软件进行配对卡方检验、Kappa一致性分析、线性回归和Bland- Altman等分析考核试剂的相关性、一致性。同时检测来自同一病人全血/血浆样品各40份，考核试剂卡对不同标本的检测能力。

2.结果

2.1标准曲线制作

用内部校准品进行测试，每个浓度测试10次，剔除离群值后取平均值。标准曲线线性范围为5.0〜500ng/mL，标准曲线具有良好的线性范围和相关性（r>0.98 ） 。

2.2分析灵敏度

以0、3.0、4.0、5.0、6.0ng/mL的内部标准品各测定20次，以变异系数接近20%的最低浓度作为试剂盒的分析灵敏度，结果如表1。表明该试剂盒的分析灵敏度为4.0 ng/mL。

2.3精密度

选择高（300.0 ng/mL）、中（100 ng/mL）、低 （10.0 ng/mL ）三个浓度的标准品进行精密考察，共考察了3批产品，结果如表2。表明该试剂盒的批内精密度<15%，批间精密度<20%，符合要求。

2.4特异性

选择10ng/mL的标准品浓度，分别在里面添加如表3中的物质及其浓度，考察干扰物质对检测结果的影响，结果如表3所示。表明干扰物质对接触结果影响甚微，偏差<10%，符合要求。

3讨论

1）本试剂盒采用的主要原材料均为国产优质原材料，大幅降低了企业的生产成本，同时也能为客 户提供优质的产品。配合本公司的快速时间分辨荧光免疫分析仪使用，能为患者现场提供快速、准确的结果，特别适合中小型医疗卫生机构，方便普通民众的检测需求。

2）本试剂盒利用时间分辨荧光微球标记抗体技术，结合固相层析技术，采用双抗体夹心法原理，MMP-9单克隆抗体标记时间分辨荧光物质（荧光信号示踪），通过时间分辨荧光免疫分析仪俘获检测区域（T区）被激发的荧光信号，通过检测区域/质控区域的值与分析物的不同浓度获得定标曲线，实现人全血/血浆中的MMP-9定量检测。

3）与一般的荧光物质标记不同，该方法采用了高熒光强度的时间分辨荧光微球进行标记，通过优化标记过程的每一个细节，使检测试剂盒具有灵敏度高、检测样本用量少，检测结果快速、准确、重复性好，保存有效期长的特点。

4）本研究对试剂盒的精密度、灵敏度、线性范围和偏倚进行了分析和评估，并与进口试剂进行对比分析，两者具有良好的相关性，比较差异无统计学意义（P>0.05 ），能够满足临床的检验需求。

5）本研发过程采用了企业与医疗机构联合研发的模式，在确保研发质量的同时，能提高了研发效率，缩短研发周期，节省时间成本。

参考文献：

[1]吕锦.基质金属蛋白酶9（MMP-9）的研究及临床应用进展[J].医学信息，2016，29（21）：16-17.

[2]苏学文，朱华. 基质金属蛋白酶-9在心血管疾病中的研究进展[J]. 内蒙古医学杂志， 2013，45（4）： 457-459.

[3]李宏丽. 慢性心力衰竭患者血清基质金属蛋白酶-9的变化[J]. 临床研究，2020，50：45