黄冠又 郝淑煜 冯洁 王亮 张力伟 张俊廷 吴震

1贵阳市第二人民医院神经外科（贵阳550081）；2首都医科大学附属北京天坛医院（北京100070）；3首都医

科大学北京市神经外科研究所（北京100070）

脑膜瘤（meningiomas）是成人颅内最常见的良性肿瘤［1］，女性多见，约占中枢神经系统肿瘤的38.3%［2］。脑膜瘤的病因学目前尚未清楚，研究表明其发病可能与生活方式［3］、环境因素［4］及基因［5］、遗传易感性［6］等多因素相关。手术切除和术后放疗是其主要治疗方式，虽大部分为良性，但术后复发率可达20%［7］。

PI3K∕AKT∕mTOR 通 路 是细 胞活 动最 基本 的信号传导途径，涉及细胞的分化、增殖和凋亡等。AKT（蛋白激酶B）是PI3K 依赖的抑制凋亡的关键因子，AKT 及相关信号通路在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用［8-9］。AKT1 是AKT 亚型之一，研究发现其信号通路与癌症、长寿、心血管疾病密切相关［10］。研究［11-12］发现脑膜瘤细胞中存在异常活化和表达的AKT1 基因，其基因突变与脑膜瘤的生长、进展和复发可能有关。但关于AKTl基因多态性与脑膜瘤发生的关联研究未见报道，本研究旨在探讨AKT1 基因多态性与脑膜瘤的易感性关系，为脑膜瘤的发病和治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采取以医院为基础的病例-对照研究，选取并收集在首都医科大学附属北京天坛医院神经外科中心于2017年10月至2018年1月手术治疗及病理确诊为脑膜瘤患者的临床资料及外周静脉血标本。病理学诊断及肿瘤分级根据中枢神经系统肿瘤WHO 2016年分类标准［13］。所有脑膜瘤患者及对照组人员均签署知情同意书，选择本院同期健康体检者为对照组。本研究获得首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会批准，并符合《赫尔辛基宣言》。200 例脑膜瘤组中，男54 例，女146 例，平均年龄（51.28±11.9）岁；200 例健康对照组中，男51 例，女149 例，平均年龄（48.52±10.17）岁。

1.2 DNA 提取和引物设计 每个受试者抽取外周静脉血5 mL，所有血样标本以乙二胺四乙酸（EDTA）防止血液凝固，放置在-20 ℃低温冰箱冻存备用。利用血液基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工技术有限公司）提取基因组DNA。引物设计根据NCBI HapMap 上数据库查找AKT1 基因在中国汉族人群中最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）≥0.1，以连锁不平衡系数r2≥0.8为标准，下载AKT1 基因SNPs 数据信息，使用HaploView 软件运行HapMap 数据，选中筛选的SNPs，包括rs1130214、rs2494746、rs2494752 三个多态位点。应用在线引物设计软件Primer3 设计引物。rs1130214 上游引物：5′-CCTGCTCCCCAGACTAGGAAAG-3′；下游引物：5′-CCCGGTACATGTTGGCCAAATGAA-3′，扩增PCR片段长度201 bp。rs2494746上游引物：5′-CTGACACCAAAGAGGGCTGTGA-3′；下游引物：5′-TTGGAGTGTTTGAGTGGGCAGCTA-3′，扩增PCR 片段长度240 bp。rs2494752 上游引物：5′-ACTGCTCCCCGAGGAAGAGTTC-3′；下游引物：5′-ACTTCAAGAACAGCCCGCAATGTC-3′，扩增PCR 片段长度204 bp。

1.3 PCR 反应和基因分型 PCR 反应条件：95 ℃2 min；11 cycles×（94 ℃20 s，65 ～0.5 ℃∕cycle 40 s，72 ℃1.5 min）；24 cycles×（94 ℃20 s，59 ℃30 s，72 ℃1.5 min）；72 ℃2 min；4 ℃for ever。PCR 产物使用ABI PRISM 3730XL 测序仪上测序，应用多重单碱基延伸SNP 分型技术（Multiplex SNaPshot）进行目的基因的多态性检测。

1.4 统计学方法 应用SHEsis在线软件进行Hardy-Weinberg（HWE）平衡检验分析和单体型（Haplotype）分析。采用SPSS 22.0 统计软件进行χ2检验或Fisher 精确概率检验比较脑膜瘤组和对照组中SNP 位点基因型和等位基因频率分布差异。应用非条件logistic 回归法分析各位点基因型与脑膜瘤发病风险的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AKT1 基因多态位点的基因型和等位基因分布 经HWE 检验，在对照组中AKT1 基因三个SNP 位点rs1130214、rs2494746 和rs2494752 基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P=0.906 9、0.339 0、0.169 3），表明样本来自同一人群，群体达到遗传平衡。脑膜瘤组rs2494746 和rs2494752 位点基因型分布和等位基因频率与对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1、2。

表1 脑膜瘤组和对照组AKT1 基因SNPs 的基因型分布Tab.1 Comparison of genotype distributions of AKT1 SNPs between two groups 例（%）

2.2 不同遗传模型下AKT1 基因位点与脑膜瘤的易感性分析 根据不同遗传模型（显性模型、隐性模型和加性模型）分析AKT1三个SNPs 与脑膜瘤发病风险的相关性（经性别、年龄因素校正，表3）。AKT1 基因位点rs1130214 在三种遗传模型分布中，脑膜瘤组和对照组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。rs2494746位点在隐性和加性基因模型下，G 等位基因携带者患脑膜瘤的危险性均显著增加（均P＜0.05）。rs2494752 位点在隐性模型下，G等位基因携带者患脑膜瘤风险增加（P＜0.05）。

表3 非条件Logistic 回归分析不同遗传模型下AKT1 基因多态位点与脑膜瘤易感性关联Tab.3 The association between AKT1 polymorphisms and meningioma susceptibility under different genetic models by unconditional logistic regression analysis

表2 脑膜瘤组和对照组AKT1 基因SNPs 的等位基因频率分布Tab.2 Comparison of allele frequencies of AKT1 SNPs between two groups 例（%）

2.3 AKT1 基因多态性单体型分析 根据连锁不平衡分析结果显示，AKT1 基因三个多态位点rs1130214、rs2494746 和rs2494752 存在明显连锁不平衡（D′＞0.9，r2＞0.3，表4），由脑膜瘤组和对照组的三个多态位点组成一个单体型块（图1）。单体型分析显示，携带CCA单体型的患者脑膜瘤发病风险降低（P＜0.05），而CGA 和CGG 单体型在脑膜瘤组中分布频率高于对照组，并且携带单体型CGA和CGG个体脑膜瘤发病风险增高（均P＜0.05），见表5。

表5 AKT1 基因多态位点单体型分析Tab.5 Haplotype analysis of polymorphism site of AKT1

图1 AKT1 基因多态位点rs1130214，rs2494746 和rs2494752 构成的连锁不平衡图Fig.1 Linkage disequilibrium map composed of the AKT1 polymorphic loci rs1130214，rs2494746 and rs2494752

表4 AKT1 基因多态位点间配对连锁不平衡（LD）及r2Tab.4 Pairing linkage disequilibrium（LD）and r2 in the polymorphic loci of AKT1

3 讨论

AKT1 基因是一种癌基因，定位于14q32.32，由14 个外显子编码，能调节细胞的凋亡和葡萄糖代谢，研究发现AKT1 在神经元中普遍存在，对神经系统的正常发育和记忆形成起关键作用，当AKT1突变时能增加精神分裂症、阿尔茨海默病的风险［14-15］。

研究［16］发现脑膜瘤中PI3K∕AKT 信号通路存在异常活化，脑膜瘤中许多生长因子通过受体酪氨酸激酶激活该通路，相关生长因子受体在高级别甚至部分良性脑膜瘤中呈高表达，并且可通过自分泌或旁分泌环路参与脑膜瘤细胞的增殖、分化和迁移等。研究表明脑膜瘤患者存在AKT1 基因变异，研究较多的是编码位于AKT1 基因pleckstrin 同源域的E17K 点突变，该点突变能导致AKT1 异常激活，其突变产生的脑膜瘤在病理亚型和生长部位与NF2 突变脑膜瘤有所不同［17］。

目前关于AKT1 基因多态性与肿瘤易感性的关联研究多集中在鼻咽癌、胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤［18］，虽然有研究表明PI3K∕AKT 信号转导通路与脑膜瘤发生有关，但迄今未有从病因学角度分析PI3K∕AKT 信号通路关键基因AKT1 基因多态性与脑膜瘤的关联研究。本研究从NCBI Hap-Map 数据库选取中国人群三个tagSNPs 位点，其中rs1130214 和rs2494746 均位于内含子区，能调控基因的表达，rs2494752 位点位于AKT1 基因5′UTR区，为潜在的启动子区域，可影响基因的转录和翻译，考虑到AKT1 基因可促进肿瘤的发生和发展，上述三个多态位点基因型变异可能会增加脑膜瘤的易感性。

本研究发现AKT1 基因三个多态位点中，rs1130214 位点的基因型和等位基因分布频率在脑膜瘤组和健康对照组中差异无统计学意义，与脑膜瘤的发病风险无关联，表明位点rs1130214 可能不影响氨基酸编码，在蛋白的功能改变上不起主要作用。但位点rs2494746 和rs2494752 基因型和等位基因分布在两组间之间差异有统计学意义，提示两位点多态性与脑膜瘤发病相关。在不同遗传模型假定下，AKT1 基因rs2494746 位点在隐性和加性遗传模型下，携带突变基因型个体患脑膜瘤风险增加。而位点rs2494752 在隐性遗传模型下，等位基因G 携带者其脑膜瘤风险增加，表明这两个多态位点携带突变型等位基因G 的个体能显著增加脑膜瘤发病风险。笔者推测位于潜在启动子区的rs2494752 位点和内含子区位点rs2494746在突变等位基因G 作用下，能引起AKT1 基因表达水平的增加，导致相关基因表达失调或蛋白功能改变，促使脑膜瘤细胞增殖或细胞凋亡受阻，可能对促进脑膜瘤的发生产生一定作用。

位于染色体上某区域的一组相关联SNP 等位位点称为单体型，脑膜瘤是发病机制不明且原因复杂的疾病，单体型分型比单个SNP 分析更有优势［19］。本研究单体型分析显示，CCA 单体型与脑膜瘤发病风险降低有关，该单体型是保护性因素。CGA 和CGG 单体型与脑膜瘤的患病风险增加相关。位点rs1130214 基因多态性与脑膜瘤无相关，但与位点rs2494746 和rs2494752 构成的单体型CCA 却能显著降低脑膜瘤发病风险，单体型CCA中包含位点rs1130214 的C 等位基因，笔者推测位于内含子区的rs1130214 位点附近的遗传改变可能在与5′UTR 区的位点rs2494752 遗传变异影响下，共同作用于AKT1 基因转录和翻译过程，最终影响AKT1 基因活性及肿瘤细胞表型和凋亡途径改变［20-21］。虽然位点rs2494746 和rs1130214 均位于内含子区，不直接影响氨基酸编码和蛋白功能，但这两个位点能构成较强的连锁不平衡，与5′UTR 区的功能多态位点rs2494752 构成的单体型CGA 和CGG 可能导致AKT1 基因活性增加，引起PI3K∕AKT 信号转导通路的异常激活，最终增加患脑膜瘤的发病风险，但其作用机制仍需进一步研究。

本研究显示AKT1 基因两个SNP（rs2494746 和rs2494752）对脑膜瘤的易感性影响，但脑膜瘤多为良性，发病原因除了遗传易感性外，还与其他因素相关，因此还需结合临床病理特征和相关因素进行多维度研究。另外，本研究样本量尚不足，且为单中心研究，没有对患者预后情况进行随访，今后还需扩大样本量进一步揭示脑膜瘤发生机制，为该病的诊断和治疗提供依据。