尹凤雷，许卫星，李淑晨，张 薇，王 娟，马洪玉，赵 芳，刘 静

（沧州市中心医院血液内一科，河北 沧州 061000）

骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）是一类克隆性造血干细胞疾病[1]。在经典型MPN 中，真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）与原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）合称经典型BCR-ABL阴性MPN。疾病之间可互相转化或合并存在，由于患者血细胞过度增殖，可导致血液淤滞、粘稠度增加，成为各种心脑血管疾病的高危因素。PV、ET的早期危险因素是血栓栓塞性疾病，主要是心肌梗死和脑梗塞，其次是出血和间歇性跛行；其晚期危险因素大多是骨髓纤维化所造成的严重贫血和心力衰竭、巨脾、出血和反复感染而导致的死亡，部分患者最终转化为急性白血病[2]。细胞因子受体-JAK-STAT 通路作为比较重要的一个细胞增殖信号转导通路，通过激活这一通路，不仅可以对细胞凋亡进行抑制，还能对细胞增殖起到一定的促进作用[3]。有研究发现[4]，大部分PMF、ET 以及PV 患者中，往往存在酪氨酸激酶JAK2的获得性点突变JAK2V617F。JAK2V617F 作为激活性的一种突变，其酪氨酸激酶活性较好，可以将下游JAK-STAT 信号传导途径激活[5]。研究表明[6]，在PV 等BCR/ABL 阴性MPN 患者的发生和发展中，JAK2V617F 是比较重要的一个因素，但需要注意的是，其组成性激活活性的发生与Ⅰ型细胞因子受体密切相关。本研究旨在分析MPN 中Ⅰ型细胞因子受体[血小板生成素受体（c-Mpl）、粒细胞集落刺激因子受体（GCSFR）以及促红细胞生成素受体（EPOR）]的mRNA 表达水平及其与JAK2V617F 突变之间的关系，以期为MPN 患者的靶向治疗提供有效理论基础，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年1月-2021年4月沧州市中心医院收治的MPN 患者50 例设为MPN组，另选择同期健康者45 例设为正常对照组和15 例慢性粒细胞白血病（CML）患者设为CML组。MPN组女22 例，男28 例；年龄30～77 岁，平均年龄（53.63±9.21）岁；疾病类型：PMF 15 例、ET 15 例、PV 20 例；病史：初治21 例，治疗29 例。CML组女10 例，男5例；年龄28～76 岁，平均年龄（53.43±9.31）岁。正常对照组女20 例，男25 例；年龄27～77 岁，平均年龄（53.34±9.45）岁。三组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，患者知情同意并签署同意书。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①临床资料完善；②符合CML 和MPN 临床诊断标准，且经骨髓相关指标检查确诊；③患者意识清醒，可正常交流和沟通。排除标准：①严重意识障碍或精神异常者；②依从性较差者。

1.3 方法

1.3.1 仪器和试剂 选择读胶仪、基因测序仪、ABI prism700 荧光定量PCR 仪以及核酸蛋白紫外分析仪，引物则包括SYBR Green Real Master Mix 和逆转录反应体系。

1.3.2 合成引物 由北京赛百盛公司合成引物，研究基因及PCR 引物序列见表1。

表1 FQPCR 扩扩增引物序列

1.3.3 实时荧光定量PCR 按照常规方法，对新鲜肝素抗凝外周血或骨髓液进行采集，在Ficoll 液中对单个核细胞进行分离备用，然后运用TRIzol 对细胞总RNA 进行提取，电泳鉴定RNA 并定量，经逆转录使cDNA 合成。同时，再行实时荧光定量PCR 反应，其中SYBR 反应体系共25 μl，对反应条件进行设置，60 ℃1 min，94 ℃45 s，94 ℃5 min，循环40 个，其中荧光本底信号为PCR 反应前3～15 个循环的荧光信号，对基线进行调节，直到适宜处，其中C（t）值为基线与荧光曲线之间的交叉点。根据C（t）βactin/C（t）Gene=△C（t），对检测基因mRNA 相对表达量进行计算，其中数值与检测基因mRNA 表达水平呈正比。

1.3.4 半定量PCR 选择8 μl 上述JAK2V617F 扩增产物，运用2%琼脂糖凝胶电泳进行处理后，在紫外灯下对结果进行观察，然后运用读胶仪AlphaImager1200进行扫描，在83 bp 位置上，若可见条带，则判断为JAK2V617F 突变阳性；若没有，则为阴性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组JAK2V617F 突变情况 MPN组中30 例存在JAK2/V617F 点突变，占比60.00%（30/50），其中PMF 患者、ET 患者以及PV 患者的阳性率分别为53.33%（8/15）、73.33%（11/15）、55.00%（11/20）；正常对照组和CML组无JAK2V617F 突变，见图1。

图1 RT-PCR 检测JAK2V617F 突变图

2.2 三组各指标mRNA 表达水平比较CML组c-Mpl、GCSFR、EPOR的mRNA 表达水平均高于MPN组、正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；MPN组GCSFR、EPOR的mRNA 表达水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但MPN组与正常对照组c-Mpl的mRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。2.3MPN组不同病史JAK2 突变患者各项指标mRNA 表达水平比较 MPN组中JAK2V617F 突变阴性初治和JAK2V617F 突变阳性初治、JAK2 突变阴性治疗和JAK2 突变阳性治疗患者的c-Mpl、GCSFR以及EPOR的mRNA 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表2 三组各项指标mRNA 表达水平比较（±s）

表2 三组各项指标mRNA 表达水平比较（±s）

表3 MPN组不同病史JAK2 突变患者各项指标mRNA 表达水平比较（±s）

表3 MPN组不同病史JAK2 突变患者各项指标mRNA 表达水平比较（±s）

3 讨论

细胞因子受体-JAK-STAT 通路是比较重要的一条细胞增殖信号转导通路，通过激活这一通路，能够对细胞增殖起到一定的促进作用，从而对细胞凋亡进行抑制[7]。细胞因子结合受体后，可对受体产生诱导作用，使寡聚体形成，并且与JAK 互相作用，激活JAK 和受体，使下游多种含特定SH2 结构域的信号分析活化，诱导二聚体形成进入核内，从而提高转录因子活性[8，9]。有文献报道[10]，在一些MPN 患者中缬氨酸被苯丙氨酸代替，这一突变体作为组成性激活的一种酪氨酸激酶，在细胞因子缺乏的条件下，能够将细胞因子受体和自身受体激活，从而将下游信号传导通路激活。

本研究结果发现，MPN组中30 例存在JAK2V617F 点突变，占比60.00%，其中PMF 患者、ET 患者以及PV 患者的阳性率分别为53.33%（8/15）、73.33%（11/15）、55.00%（11/20），但是正常对照组和CML组无JAK2V617F 突变，这一结果与田辉云等[11]、Mullally A 等[12]研究报道基本一致。通常情况下，在JAK2V617F 参与MPN 发病中Ⅰ型细胞因子受体发挥着极其重要的作用，二者只有相互作用，才能增强组成性激活活性，若JAK2V617F 脱离Ⅰ型细胞因子受体后，其生物活性则得不到有效发挥[13，14]。同时，细胞表面Ⅰ型因子受体如c-Mpl、GCSFR 以及EPOR 等，作为一种同源二聚体，当细胞因子结合其受体后，可使JAK2的二聚体形成，并且互相磷酸化，然后增强STAT5的转录因子活性，从而导致造血细胞的分化、增殖以及生成[15，16]。若细胞因子/细胞因子受体缺乏，则会导致造血细胞凋亡[17，18]。过表达细胞因子能够使JAK2V617F组成激活作用增强，提示JAK2V617F 需要细胞因子受体作为桥梁，并且在信号传导与激活中发挥着极其重要的作用。此外，本研究结果显示，CML组c-Mpl、GCSFR、EPOR的mRNA 表达水平均高于MPN组、正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；MPN组GCSFR、EPOR的mRNA 表达水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但MPN组与正常对照组c-Mpl的mRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；MPN组中JAK2V617F 突变阴性初治和JAK2V617F突变阳性初治、JAK2 突变阴性治疗和JAK2 突变阳性治疗患者的c-Mpl、GCSFR 以及E POR的mRNA 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示与正常对照组比较，MPN 患者GCSFR、EPOR的mRNA 表达水平较高，但是经对症治疗后，MPN组中JAK2V617F 突变阳性治疗患者的GCSFR、EPOR表达水平下降，这一结果与王晓培等[19]研究报道一致，提示其与JAK2V617F 是否突变无关。

综上所述，JAK2V617F 或Ⅰ型细胞因子参与MPN的发展，并且在多种造血系统肿瘤疾病中Ⅰ型细胞因子的表达水平较高，但其并不是决定MPN 发病的唯一因素。