逄亚宁，王 聪，刘 奇，张 雷，李光华

（大理大学基础医学院医学微生物与免疫学教研室，云南 大理 671000）

结核病（tuberculosis，TB）是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的威胁人类健康的疾病，也是当今世界引发高死亡率的主要传染性疾病[1，2]。在寻找新的药物靶点、提高诊断技术、加强疫苗的保护力方面都面临着新的挑战[3]。铁是结核分枝杆菌生长与代谢的所需元素。BfrA 与BfrB 作为结核分枝杆菌的铁储存蛋白，在维持铁环境稳态中发挥关键作用，其主要是在压力环境下，通过维持铁的平衡进而保护结核分枝杆菌的生长。同时，二者在保护结核分枝杆菌免受氧化应激损害中也发挥了重要作用。BfrA 是结核分枝杆菌在低铁条件下生长的重要蛋白[4]。有研究发现[5]，BfrA 蛋白对于活动性结核病具有诊断意义。本研究通过生物信息学技术对结核分枝杆菌BfrA 蛋白的结构和功能进行预测与分析，以了解其致病机制及寻找该蛋白在药物新靶点与诊断及预防方面的潜在应用价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 资料来源 在NCBI GenBank数据库中获取MTB BfrA 蛋白的FASTA 形式氨基酸序列：

登录号为NP_216392.1，其编码基因Rv1876的Gene ID 为885767。

1.2 方法 运用NCBI的ORF Finder 在线软件分析基因Rv1876的开放阅读框架；通过NCBI的Blastp工具分析BfrA 蛋白与人类蛋白的同源性；采用ProtParam、ProtScale 和SOSUI 在线软件预测该蛋白理化性质；综合利用TargetP 和PSORT、TMHMM、SignalP 分析其在细胞中的定位与分泌情况；通过Motif Scan 预测其翻译后修饰位点；使用SOPMA、SWISS-MODEL 在线软件预测其二级结构和三级结构；采用BepiPred 和ABCpred 软件综合分析该蛋白B 细胞抗原表位；使用NetMHCII、NetMHCIIpan、NetCTL、SYFPEITHI 软件在线预测并分析其T 细胞抗原表位；运用STRING 软件预测其蛋白相互作用网络。所用基因与蛋白质分析软件见表1。

表1 所用基因与蛋白质分析软件

2 结果

2.1 基因Rv1876 开放阅读框架 基因Rv1876 全长480 bp，位于H37Rv 全基因组的2125340—2125819区域，起始密码子是ATG，终止密码子为TGA。

2.2 同源性 NCBI的Blastp 结果显示，BfrA 蛋白与人类蛋白没有显著同源性，发生交叉反应的几率较低。

2.3 理化性质 通过ProtParam 在线软件预测，BfrA蛋白含有159 个氨基酸，分子式为C802H1276N218O259S7，总原子数为2563，相对分子质量为18340.68，理论等电点为4.50。异亮氨酸是含量最多的氨基酸，占14.5%，色氨酸含量最低，为0.6%。带负电荷残基数（Asp+Glu）为31，带正电荷残基数（Arg+Lys）为15。半衰期为30 h，脂溶性指数为95.72，总平均亲水性系数为-0.455。在280 nm 波长处，如所有半胱氨酸残基成对形成胱氨酸，则其消光系数为13 075，吸光度为0.713；如所有半胱氨酸消失，则其消光系数为12 950，吸光度为0.706。不稳定系数为35.36，提示该蛋白质属于稳定性蛋白。

2.4 疏水性和可溶性 经ProtScale 在线软件分析其亲疏水性，亲、疏水性分别用负值、正值表示，在113位氨基酸处亲水性最强，得分为-2.144；在第121 位氨基酸处疏水性最强，得分为1.856；亲水性氨基酸总数大于疏水性氨基酸总数，见图1。经SOSUI 软件进一步分析，该蛋白的疏水性平均值为-0.454 717，属于可溶性蛋白质。

图1 BfrA 蛋白的亲疏水性预测

2.5 跨膜区域、信号肽和亚细胞定位 通过TMHMM-2.0 分析，BfrA 蛋白不存在跨膜区域（图2）；SignalP-4.1 预测该蛋白的D 值为0.103，小于阈值0.450（图3）；TargetP-1.1 软件显示BfrA 蛋白为分泌性蛋白的可能性为0.107，定位在其它位置的可能性为0.886（图4）；PSORT 软件分析显示，该蛋白定位于细胞质。

图2 BfrA 蛋白跨膜区预测

图3 BfrA 蛋白的信号肽预测

图4 BfrA 蛋白的亚细胞定位预测

2.6 蛋白翻译后修饰位点 Motif Scan 在线软件分析，该蛋白含有4 个CK2-磷酸化位点（44-47、48-51、82-85、136-139），1 个豆蔻酰化位点（104-109），3 个PKC-磷酸化位点（59-61、76-78、82-84），1 个TYR-磷酸化位点（143-149）。

2.7 二级结构和三级结构 SOPMA 软件预测BfrA 蛋白二级结构包含α-螺旋（Hh）、β-转角（Tt）、无规则卷曲（Cc）、β-折叠（Ee），分别占79.87%、1.89%、16.35%、1.89%，见图5。β-转角与无规则卷曲结构较松散，多位于蛋白质表面，是优势抗原区段。SWISS-MODEL 在线软件通过对BfrA 蛋白进行比较建模，构建其三级结构，预测结果见图6。

图5 BfrA 蛋白二级结构预测

图6 BfrA 蛋白三级结构预测

2.8 B 细胞抗原表位 利用BepiPred 1.0 Server 和ABCpred 软件综合预测BfrA 蛋白的B 细胞表位，得到4 个共同的B 细胞抗原表位，见表2。

2.9 T 细胞抗原表位

2.9.1 CD4+T 细胞抗原表位 使用NetMHCII-2.3 和NetMHCIIpan-4.1 软件，选取DRB1-0101、DRB1-0301、DRB1-0401、DRB1-0701、DRB1-1101、DRB1-1501 作为HLA 亚型代表，得到10 条共同的强结合Th 细胞抗原表位肽段，见表3。

表3 CD4+T 细胞抗原表位分析结果

2.9.2 CD8+T 细胞抗原表位预测结果 结合NetCTL-1.2 和SYFPEITHI 对BfrA 蛋白的HLA-A2 与HLAA3 限制性CTL 抗原表位的预测结果，得到5 个共同优势抗原表位（临界值为21），见表4。

表4 CD8+T 细胞抗原表位分析结果

2.10 蛋白相互作用网络 采用STRING 预测与BfrA相互作用的蛋白质，显示其与hemZ、mmcO、Rv1877、bfrB 等蛋白形成相互作用网络，见图7。

图7 蛋白相互作用网络预测

3 讨论

结核病耐药菌株的广泛蔓延以及结核病与艾滋病的相互作用，给结核病的防控工作带来了严峻的考验[6，7]。卡介苗是目前唯一可用作预防结核病的疫苗，对成人的保护效果并不稳定[8]。因此，为了更好地控制结核病的流行与传播，提高结核病的诊断技术与治疗水平，需要寻找新的药物靶点、增强诊断技术的特异性与灵敏性以及研发更具有保护效力的结核病疫苗。

生物信息学是应用计算机技术探索生命科学的相关学科，目前已被医学领域广泛采纳与应用[9]。本研究通过生物信息学技术手段对结核分枝杆菌的BfrA 蛋白加以分析，以期寻找其在结核病的药物靶点、免疫诊断技术和疫苗开发方面具有的潜在应用，结果发现BfrA 蛋白是一种具有亲水性质的可溶性蛋白质，不具有信号肽且不属于分泌蛋白，其位于细胞质中，与HemZ、MmcO、Rv1877、BfrB 等蛋白发生相互作用。且经生物信息学软件综合分析发现，BfrA蛋白具有4条可引起强烈体液免疫的B细胞表位肽段，分别为MQGDP、RAESR、KQDTT、ADEEEH。B细胞及抗体通过多种途径参与机体抗结核菌免疫反应的调节，B 细胞可作为抗原提呈细胞影响T细胞的分化及功能，也可调节肉芽肿免疫细胞的作用，抗体介导形成的免疫复合物可调节巨噬细胞与树突状细胞等效应细胞的功能[10，11]。同时，经预测发现该蛋白拥有10条与MHC-Ⅱ类分子强结合的肽段，分别为LDGLPNYQRIGSLRI、DGLPNYQRIGSLRIG、GLPNYQRIGSLRIGQ、LPNYQRIGSLRIGQT、PNYQRIGSLRIGQTL、ADLAIEYDVLNRLKP、DLAIEYDVLNRLKPG、LLEKIVADEEEHIDY、LEKIVADEEEHIDYL、EKIVADEEEHIDYLE。MHC-Ⅱ类分子主要将摄取加工的抗原肽提呈给CD4+T 细胞识别[12]。经结核分枝杆菌刺激而活化的CD4+T 细胞通过分化成Th1、Th17 多种T 细胞亚群及分泌IFN-γ、IL-2、IL-17 等多种细胞因子，并在病原菌的感染过程中发挥免疫保护功能。其中CD4+Th1 细胞通过分泌IFN-γ 细胞因子介导的控制病原菌的方式是机体抗结核感染的主要保护途径[13-16]。CD8+T 细胞在结核病的免疫保护中同样具有潜在价值，CD8+T 细胞经MHC-Ⅰ类分子参与提呈的特异性抗原肽刺激而活化，可通过分泌穿孔素、颗粒酶、细胞溶素等活性物质或者Fas-FasL途径裂解靶细胞、诱导靶细胞凋亡或者直接作用于结核分枝杆菌[17-20]。同时，CD8+T 细胞也可通过分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α 参与抗结核保护[21-24]。本研究预测到BfrA 蛋白具有5 个CD8+T 细胞优势表位，且BfrA 与人类蛋白没有显著相似性，发生交叉反应的可能性极低。因此，其B 细胞表位和T 细胞表位分别引起的体液免疫与细胞免疫在快速诊断技术的建立与新型疫苗的研发方面具有指引意义[25-27]。

综上所述，通过生物信息学技术预测到BfrA 蛋白具有多个B 细胞及T 细胞抗原表位，在结核病的预防和诊断方面具有应用前景。