杜 玮 陈古丽 玛依拉·艾尼瓦 阿曼古丽·牙森 汪 阳 苗书魁 汪 萍夏俊李威*

（1新疆畜牧科学院，新疆乌鲁木齐 832003；2新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心，新疆乌鲁木齐 830000；3新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，新疆乌鲁木齐 830000；4新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830000）

巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的在野 生动物和畜禽中广泛传播的传染病。败血症和出血性炎症为急性病例的特征，由此被称为出血性败血症[1]，表现为皮下、关节以及各脏器的局灶性化脓性炎症为慢性病例的特征。巴氏杆菌病由于在很多动物中并没有表现出血性败血症的特点，但是其他一些疾病却有出血性败血症的特征。因此，为避免混淆，将其命名为多杀性巴氏杆菌更为合适。

牛传染性胸膜肺炎的别名是牛传染性支原体肺炎，俗称牛肺疫，主要是由肺炎支原体感染引起的一种急性接触性传染病。该病的临床症状明显，病牛咳嗽、体温升高，牛群的正常生长发育受到影响。感染该病的牛年龄大小不同，牛的致死率也略有不同。该病主要病理变化是纤维素性胸膜肺炎，病死率高、急性耐受的逐渐转为慢性型的病牛，成为养殖场主要传染源，是造成疾病反复流行和蔓延的主要原因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要试剂有BHI培养基、革兰氏染色液、DL2000核酸Marker。试验仪器有200 μL移液器、培养皿、5 mL注射器。试验动物为19～23 g健康巴贝斯小鼠6只。

1.2 临床检查及剖检

通过常规的临床检查方法检查病牛，并剖检死亡牛只，然后逐一观察每个脏器的病变情况并将有明显病变的脏器进行摘取拍照，记录其病变情况。

1.3 实验室诊断

1.3.1 细菌的分离培养。在无菌条件下处理牛的肺脏病变组织，即首先将肺脏组织剪取部分涂抹于BHI固体培养基上，其次剪取另外一部分接种到BHI液体培养基上，最后将固体培养基放到37℃温箱中培养24 h，将液体培养基放到37℃水平摇床上，在150 r/min条件下增菌培养24 h。

1.3.2 革兰氏染色和镜检。从摇床上取出培养的菌液，观察增菌培养是否成功，若有大量细菌长出便可用常规染色方法进行革兰氏染色，染色完毕后镜检并观察目的细菌的形态。固体培养基培养到一定时间后观察，如果有菌落长出就选取疑似巴氏杆菌的菌落染色并镜检观察其形态。最后挑取疑似巴氏杆菌的单菌落接种到液体培养基中，然后放到37℃水平摇床上培养 （150 r/min），24 h后取出菌液染色镜检，观察细菌形态。此过程是将细菌进一步纯化，使目的细菌更加容易被分离出来。

1.3.3 巴氏杆菌PCR检测。将培养的细菌进行PCR检测，引物为巴氏杆菌鉴定引物和巴氏杆菌a型鉴定引物；扩增体系为 25 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物各 1 μL，超纯水补至 25 μL，混合后放到PCR扩增仪中。反应条件为94℃预变性5 min，94℃循环变性 30 s，56℃退火复性30 s，72℃延伸40 s，30个循环；72℃终延伸10 min，最后在4℃下保存。反应结束后，用琼脂凝胶回收试剂盒将PCR产物回收后，送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3.4 支原体病原PCR检测。将牛的肺脏组织进行充分研磨，将其处理成组织悬液后参照DNA提取试剂盒说明书提取DNA。参照已报道的牛传染性胸膜肺炎基因的保守序列及文献[2]，用生物软件DNAstar设计鉴定引物，进行PCR扩增，方法同上。

1.3.5 致病性试验。将纯化的菌液分别给4只健康小鼠的腹腔注射200 μL，对照组将生理盐水分别给另外2只健康小鼠的腹腔注射200 μL，并随时观察试验组和对照组小鼠的情况。

2 结果与分析

2.1 临床症状及剖检病变组织分析

该病发病急且快，病牛会表现出离群独居的现象。刚发病时，病牛发烧至42℃，呼吸频率加快，精神状态萎靡，身体日渐消瘦，生长发育不好，被毛没有光泽且比较凌乱是大多数病牛的状态。随着病情加重，患病牛停止进食，不规律反刍，有清鼻液流出，然后变稠。咳嗽1周以后，病牛病症加重，开始出现干咳并伴有疼痛，腹部明显起伏，频频顾腹，有气喘的表现，气管内可以听到明显的鼾声。生病牛只流出铁锈色鼻液，而且经常粘在鼻腔上面。解剖病牛后发现，病变主要集中在肺和胸膜。胸腔内积聚大量淡红色或淡黄色纤维状渗出液，数量有多有少。仔细观察发现这些渗出液里有少量纤维网状物质或有的贴附在肺脏组织的表面[3]。剖检结果发现病死牛的肺组织表面有大小不一样的明显的胶体浸润和肝脏病灶。病变肺组织肿大，质地坚硬，切面大理石状是该病病死牛的典型特征。

2.2 革兰氏染色及镜检结果分析

BHI固体培养基上的细菌生长状况良好，有圆形、半透明状、质地湿润小菌落（图1）长出。镜检可见球杆形状，单个或者成对排列的革兰氏阴性菌（图2）。

2.3 PCR检测结果分析

PCR 结果表明，在 492、980、512、510 bp 处均出现明亮条带（图3、4），与预期相符，说明牛支原体、牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌均呈阳性。

2.4 致病性试验结果分析

试验组和对照组注射相应液体后8 h，试验组小鼠开始行为呆滞，不喜进食，12 h后陆续死亡。对照组的小鼠正常进食和活动，且没有死亡小鼠（图5）。

3 结论与讨论

牛传染性胸膜肺炎的诊断和预防技术已经比较成熟。相关文献研究表明，我国的中兽医对该病的治疗方法多种多样，符合我国当今社会对绿色产品以及无公害养殖的追求。因此，该病的治疗已经逐步实行中兽医治疗以及借助西医准确诊断，中医针对性对症治疗，中西医结合，中医调理治疗病牛和西医辅助治疗方法等，使养殖生产的牛肉产品最大程度地满足公众的需求，有利于养殖户进一步提高养殖效率。动物抵抗力是巴氏杆菌病发生的先决条件，任何会降低动物抵抗力的因素都会促进巴氏杆菌病的发生和流行。气温突降会使动物的抵抗力下降，多杀性巴氏杆菌会趁机侵入动物体内，通过淋巴结进入动物的血液从而形成动物菌血症[4-5]。牛肺炎和牛恶性卡他热易与该病的临床症状相混淆[6]。该次病症为传染性胸膜肺炎和巴氏杆菌的混合感染，结合金映红等[7]的研究可以看出牛羊感染肺炎不再仅仅是单一感染，而开始出现了混合感染现象，且诊断方式应以实验室诊断为主，才能有更准确的诊断结果。

健康的牛身上一般会有支原体和巴氏杆菌生活，会导致牛在受到各种应激刺激（如断奶、运输、感冒、营养不良等）后发病。综合来看，应遵循“管理为主、治疗为辅、防治结合”的原则。当发现有发病迹象的牛时，首先应立即将所有病牛用具和使用场所隔离，并进行全面消毒；病牛痊愈或者症状减轻后，不用立即转回健康牛所在的场所，终生饲养在治疗圈内是最好的办法；慢性感染或者症状较轻的牛只，会对外界进行长时间的排毒，从而感染健康牛，因而应对这些牛加强管理，不容忽视；孕牛和断奶之前的小牛也要加强饲养管理。