吕丽娟，张晓明，穆赢通，樊东昌，王俊杰

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，呼和浩特 010018)

蒙药材蓝盆花是川续断科蓝盆花属，华北蓝盆花(ScabiosatschiliensisGrunning.)和窄叶蓝盆花(ScabiosacomosaFisch. ex Roem. et Schult.)的干燥花序，蒙药名为套森-套日麻，性味涩、甘、钝、腻、燥、重、凉；具有清热、清“协日”泻火的功效，临床常用基础药物来治疗多种疾病，主要用于治肺热、肝热、咽喉热等疾病[1-3]。通常所用药源采自野生植株。由于环境破坏导致资源紧缺，近几年开始采用种子繁殖人工种植途径。但市场上蓝盆花种子(瘦果)胚发育不良，质量参差不齐，严重限制了蓝盆花的大规模种植。针对以上问题需制定蓝盆花种子质量分级标准，确保种子质量是种植蓝盆花的关键问题之一。种子生活力是种子质量检测的重要指标之一[4]，目前测定生活力的常见方法有TTC法、红墨水法、BTB法和纸上荧光法等。其中，TTC法是目前国际上常用的方法，大部分植物都采用此方法，如油桐[5]、黄芪[6]、滇重楼[7]；荧光法主要用于含有荧光物质的种子，如白菜、甘蓝[8]；锁阳[9]、山豆根[10]常采用溴麝香草酚蓝(BTB)法；红墨水法测定种子生活力采用较少。本试验采用4种方法对窄叶蓝盆花种子生活力进行测定，以期找到蓝盆花种子生活力测定的最佳方法，并对最佳方法进行优化，为蓝盆花种子质量分级提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料采自内蒙古锡林郭勒盟正镶蓝旗、呼伦贝尔市陈巴尔虎旗、呼和浩特市武川县人工种植收获的窄叶蓝盆花种子，收获后在4℃低温下保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1发芽率测定

在清选好的窄叶蓝盆花净种子中，随机各挑选300粒，每重复100粒，3次重复，用75%对的酒精消毒45 s，用清水3次冲洗，放置于2层定性滤纸的培养皿中，25℃恒温培养，每天进行观察记录，保持湿润。每天观察时要开盖放置20 min左右透气，对发霉的且没有腐烂的种子用蒸馏水冲洗后继续进行发芽，统计发芽数，观察连续5 d无发芽种子即发芽停止。

发芽率计算方法为：发芽率(%)=发芽种子数/供势种子数×100%。

1.2.2种子生活力测定

溴麝香草酚蓝(BTB)法[10]:将完整无损的种子在25℃下浸泡2 h后去皮，煮沸失活种子做对照，适当距离放入冷却好的凝胶培养皿内，放入25℃的恒温箱内培养24 h，放置pH为5.5～9.0的精密试纸，观察pH试纸上出现黄色晕圈的为有活力种子，反之为无活力种子，统计记录。

纸上荧光法[11]：将完整无损的种子在25℃下浸泡2 h后去皮，放在湿滤纸上放置2 h风干滤纸，于紫外荧光灯下照射种子发光情况，发光为无生活力种子，反之为无活力种子，统计记录，将发光与不发光种子放入25℃温箱进行发芽验证。

红墨水法[11]：将普通红墨水按1∶9的比例稀释作为染色剂，将25℃下浸泡2 h后的种子剥皮，加入配好的红墨水中置于30℃恒温染色20 min，冲洗观察，将煮沸失去活力的种子作对照，种胚不着色或是微着色为有活力种子，反之无活力。

氯化三苯基四氮唑(TTC)法[11-12]：煮沸失活种子作对照，配置0.5% TTC溶液，将25℃下浸泡2 h后种子去皮，倒入TTC溶液置于30℃的恒温箱内避光放置1 h，统计种子颜色。种胚被染成鲜红色或红色为有活力的种子，反之为无活力种子。计算方法为：生活力(%)=有活力种子数/供势种子数×100%。

1.2.3TTC法最适条件参数确定

采用5因素4水平正交实验设计(表1)，将窄叶蓝盆花种子在不同温度下，用清水浸泡30 min、60 min、90 min，120 min去皮放入提前清洗好的培养皿中，加不同浓度TTC于培养皿内，浸没种子，将培养皿置于不同温度的恒温箱内避光染色，3次重复，染色30 min、60 min、90 min、120 min时，统计种子颜色。

表1 正交实验生活力测定因素水平

1.2.4数据处理

采用DPS软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 四种方法测定种子生活力结果与发芽率关系分析

2.1.1红墨水法

采用红墨水法对3个地区窄叶蓝盆花种子生活力进行测定，结果表明种子生活力与发芽率差异不显著(表2)。

2.1.2纸上荧光法

纸上荧光法测得3个地区窄叶蓝盆花种子生活力值为4种方法中最高，种子生活力与发芽率差异显著(表2)，发光与不发光的种子均有部分种子发芽。

2.1.3BTB法

BTB法测得的3个地区窄叶蓝盆花种子生活力均与发芽率无显著差异(表2)，种子周围出现黄色光圈不易分辨(图1)。

表2 不同方法测定种子生活力比较

2.1.4TTC法

TTC法测得的3个地区窄叶蓝盆花种子生活力与发芽率无显著差异，而且种子染色情况易辨别(图1)。

IY :A1.红墨水法有生活力种子；A2.红墨水法无生活力种子；B.纸上荧光法有生活力活和无生活力种子；C1.TTC法有生活力种子；C2.TTC法无生活力种子；D.BTB有生活力活和无生活力种子。

2.1.5不同方法生活力比较

结果表明4种方法测定窄叶蓝盆花种子生活力中，红墨水法与纸上荧光法差异显著，红墨水法测得的种子生活力低于发芽率，纸上荧光法发光与不发光种子均有部分种子发芽，两种方法都不适合测定窄叶蓝盆花种子生活力。BTB法与TTC法测得的种子生活力差异不显著(P<0.05)，都略高于发芽率。

2.2 TTC法最佳条件筛选分析

BTB法与TTC法都可用于对窄叶蓝盆花种子生活力进行测定，但BTB法相较于TTC法操作繁琐且黄色光圈不易观察，因此测定窄叶蓝盆花种子生活力最适方法为TTC法。

采用5因素4水平的正交实验对TTC法进行优化，得出结果(表3)。窄叶蓝盆花种子生活力最低组合为组合1在25℃下浸种30 min，用浓度为0.1%的TTC在25℃恒温箱中染色避光30 min和组合8在40℃下浸种60 min，用浓度为0.5%的TTC在30℃恒温箱中染色避光30 min的种子不染色或染有少量浅粉色；生活力最高组合为组合11，在35℃下浸种60 min，用浓度为0.1%的TTC在30℃恒温箱中染色避光120 min，种子染成鲜红色或红色。对所得的正交实验进行极差分析，得出表3，根据所得极差R值得大小，5个因素对种子生活力的影响大小为：TTC浓度>染色时间>浸种时间>浸种温度>染色温度，TTC浓度对种子生活力的测定值影响最大，染色时间与浸种时间次之，浸种温度与染色温度对种子生活力的测定值影响较小。

表3 TTC法正交实验结果

通过分析J1、J2、J3、J4总结各因素对窄叶蓝盆花种子生活力影响规律，挑选出测定窄叶蓝盆花种子生活力的最优条件。浸种时间：随着浸种时间变长，种子生活力呈现先升高后降低的趋势，J3值达到最大，90 min为最适浸种时间；浸种温度：随着浸种温度升高，生活力先升高达到一定值时趋于稳定，J3达到最大，之后再升高温度对生活力影响不显著，35℃为最适浸种温度；TTC浓度：随着TTC浓度的增加，生活力逐渐降低，高浓度TTC抑制种子的种子生活力，TTC浓度为0.1%时生活力最高；染色温度：染色的温度相较于其他因素，对种子生活力影响较小，随温度的增加，种子生活力呈先增加后平稳，温度达到35℃后，再增大温度，种子生活力差异不显著；染色时间：生活力随着染色时间的增长而升高，种子颜色由浅到深90 min后被染色种子数稳定不变，颜色最深。综合上述所确定的较优组合为窄叶蓝盆花种子在35℃下浸种90 min，用浓度为0.1%的TTC在35℃温箱中避光染色90 min。

对正交实验进行方差分析，结果表明(表4)对于5个因素对实验结果都有显著影响。

表4 TTC法正交实验方差分析

3 讨论与结论

3.1 窄叶蓝盆花种子生活力的最佳测定方法

种子生活力反映了种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力，是判断种子质量的重要指标，真实的发芽率小于或等于种子的生活力，并且对于种子质量分级有重要的作用[4,13-14]。本研究中采用目前最常用的四种生活力测定方法测定窄叶蓝盆花种子生活力，结果显示红墨水法测定结果为生活力低于发芽率，沈宇峰等[13]用红墨水法测定白术种子生活力也出现了生活力低于发芽率的情况，因此，此方法不适合测定窄叶蓝盆花及白术种子生活力；纸上荧光法只适合测定含有荧光物质种子的生活力，已有研究表明此法用来测定十字花科类种子生活力，效果最佳；BTB法测定窄叶蓝盆花种子周围黄色光圈不明显，不宜判断，孙荣进等[15]利用BTB法测定蔓荆子种子生活力，虽然黄色晕圈比较明显，但死种子和活种子间差异不显著，难判断；TTC法测定的种子生活力接近发芽率且容易辨别种子有无生活力，为最适测定蓝盆花种子生活力的方法。

3.2 TTC法测定窄叶蓝盆花种子生活力的最佳条件

本实验中发现随着TTC染色时间的增加，染色效果先好后差，这与雷慧霞等研究的芍药种子生活力的研究结果相似[12]。通过设置了不同的染色处理，发现浸种时间、浸种温度、染色时间、染色温度、染色浓度均对蓝盆花种子生活力有显著影响，但是TTC浓度影响最大，染色时间次之，这与芍药种子和独活种子结果不同，芍药种子生活力影响最大的因素是浸种时而独活种子生活力影响最大的因素是染色温度[12,16]，而影响白鲜[17]种子生活力最大的因素是浸种温度，其次是TTC浓度。

实验结果表明窄叶蓝盆花种子生活力采用TTC法测定的最佳条件为：种子在35℃下浸种30 min，用浓度为0.1%的TTC在35℃温箱中避光染色90 min。