吴丽萍，苏兴隆，王兆健，俞年军，彭代银,2，邢世海,2*

(1 安徽中医药大学 药学院，合肥 230012；2 安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，合肥 230012)

霍山石斛 (Dendrobiumhuoshanense)又名米斛，为兰科(Orchidaceae)石斛属多年生附生草本植物，茎为其主要的药用部位，具有益胃生津、滋阴清热等功效[1]。现代研究表明，霍山石斛含有多糖、生物碱、酚酸、氨基酸等多种药用成分[2-4]。其中多糖是其主要的活性成分，主要由葡萄糖、甘露糖等单糖构成，具有抗白内障、抗氧化、免疫调节、保肝等药理活性[5-7]。GDP-甘露糖 4,6-脱水酶(GDP-mannose 4,6-dehydratase,GMDS)是GDP-L-岩藻糖合成途径中的关键酶，可以催化GDP-D-甘露糖形成GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，在GDP-酮-6-脱氧甘露糖3,5-表异构酶的催化作用下，转化成GDP-L-岩藻糖, 从而参与多糖的形成[8]。GDP-L-岩藻糖是一种广泛存在于生物中的糖基供体和代谢中间产物，参与生命代谢的调节，合成工艺十分复杂[9]。有关GDP-甘露糖4，6-脱水酶基因在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、发菜(Nostocflagelliforme)及高山被孢霉(Mortierellaalpina)等[8-14]物种中已被报道，目前对DhGMDS基因的相关研究还未见报道。

石斛属多数植物对生态环境要求严格, 喜温怕冷，生长适温为18～32 ℃，一般最佳生长温度为25 ℃， 在5 ℃以下或35 ℃以上会停止生长[15-16]。北方地区常年气温极低，低温造成的冷害、冻害，严重影响其生存、产量和品质。霍山石斛主产于大别山区安徽霍山及邻近地区，低温不利于霍山石斛在北方的引种栽培和推广。因此，研究霍山石斛的耐寒性，克隆霍山石斛抗性相关基因，解析其胁迫响应和抗性机制，具有重要的科学意义和应用价值[17]。

本研究基于前期霍山石斛转录组数据，对霍山石斛GDP-甘露糖 4,6-脱水酶基因(DhGMDS)及其启动子进行克隆及分析，采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析DhGMDS基因在霍山石斛不同部位的相对表达情况，并分析低温(4 ℃)胁迫处理下DhGMDS基因的表达，为进一步解析霍山石斛抗寒机制和遗传改良提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与胁迫处理

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)成熟未开裂的蒴果采自安徽省霍山县太平畈乡王家店村，由“霍山石斛非物质文化遗产传人”何祥林先生提供。1)前期处理。将蒴果用洗衣粉水(5 g洗衣粉加入300 mL水) 浸泡15 min，流水冲洗 30 min；置于无菌条件下，用体积分数75%乙醇浸泡震荡45 s，无菌水润洗2次；再用体积分数30% NaClO溶液浸泡15 min，无菌水润洗5次；吸干蒴果表面水分，横向切开，接种于萌发培养基(1/2 MS，含0.2 mg·L-1NAA、30.0 g·L-1蔗糖和6.5 g·L-1琼脂粉，pH 6.0)，于温度(23±2) ℃、光照11 h·d-1、光照度1 500～2 000 Lx条件下，培养霍山石斛实生苗。2)低温(4 ℃)胁迫处理。取长势相近的一年生霍山石斛实生苗，于温度4 ℃、光照11 h·d-1、光照度1 500～2 000 Lx条件下培养，处理0、24、48和72 h后分别取整株霍山石斛，清水洗净，滤纸吸干水分，用于总RNA和gDNA的提取。每个处理组设置3个生物重复，每个重复3盆霍山石斛。

1.2 方 法

1.2.1 霍山石斛总RNA及基因组DNA的提取采取Liu等[18]方法提取霍山石斛总RNA，使用FastQuant RT Kit (Tiangen Biotech，北京) 进行反转录合成cDNA；采用改良的CTAB方法[19]提取霍山石斛基因组DNA。

1.2.2DhGMDS基因克隆根据课题组前期的霍山石斛转录组数据[20]及序列相似性比对结果，筛选了一个参与多糖合成途径的编码GDP-甘露糖 4,6-脱水酶的候选基因，命名为DhGMDS，用 Primer 5.0 软件设计特异引物进行PCR扩增，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成(表1)。以霍山石斛总RNA反转得到的cDNA为模板，DhGMDS-F和DhGMDS-R为引物进行PCR扩增。反应体系：PrimeSTAR®DNA Polymerase 25 μL，上下游引物(10 mmol/L)各1 μL，模板1 μL，无菌水22 μL。反应参数为：95 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒(Tiangen Biotech，北京)纯化回收 PCR产物，纯化后与 pMD18-T 载体过夜连接，然后转化DH5α 感受态，进行挑斑筛选，将含有目的片段的阳性菌送生工生物工程上海股份有限公司测序。使用引物DhGMDS-F′和DhGMDS-R′，以霍山石斛基因组DNA为模板进行PCR扩增，克隆该基因在基因组上的全长序列，送生工生物工程上海股份有限公司测序。

1.2.3DhGMDS基因的生物信息学分析根据得到的cDNA序列，在线进行该基因及其他同源序列的相似性比对(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov)和蛋白质理化性质预测分析(http://web.expasy.org/protparam)[21]；用TMHMM在线程序 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)[22]分析该蛋白质的可能跨膜区；利用PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)[23]预测该基因编码蛋白的亚细胞定位；利用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)预测该蛋白的二维结构；用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)[24]进行编码蛋白的三维结构预测；并利用MEGA X软件[25](neighbor-joining，邻位相连法) 构建该基因的系统进化树。

1.2.4DhGMDS基因启动子的克隆和元件功能分析利用Primer 5.0设计Genome Walking特异引物SP1、SP2和SP3(表1)，使用染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit, TaKaRa公司)克隆DhGMDS启动子。PCR反应体系：染色体步移三轮PCR模板依次为霍山石斛基因组DNA、第一轮PCR产物(稀释100倍)、第二轮PCR产物(稀释100倍)1.0 μL、dNTPs (2.5 mmol·L-1) 8.0 μL、10 × LA PCR 缓冲液5 μL、TaKaRa LA Taq 0.5 μL、AP2 (100 μmol·L-1) 1.0 μL和SP(10 μmol·L-1) 1.0 μL；ddH2O将反应体系补充到50 μL。将每轮扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取第三轮得到的特异片段，胶回收试剂盒回收纯化片段；再将目的片段连接到pMD18-T载体上，转化、测序。采用数据库(http: //www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)[26]分析预测顺式作用元件。

表1 霍山石斛 DhGMDS 基因分析所需引物

1.2.5DhGMDS基因的qRT-PCR表达分析分别提取霍山石斛根、茎、叶、花各组织的RNA，以反转录cDNA为模板，使用Roche Z480实时荧光定量PCR仪，分析DhGMDS基因在霍山石斛根、茎、叶、花各组织表达情况；分别提取不同时间(0、24、48和72 h)低温处理后整株霍山石斛RNA，以反转录cDNA为模板，分析DhGMDS基因低温处理的表达规律。每个样品做3个平行实验，3个生物学重复。以DhGMDS-RT-F和DhGMDS-RT-R为引物，以18SrRNA作为内参基因，参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂 (TaKaRa) 说明书进行荧光定量PCR扩增，采用2-ΔΔCt法对数据进行定量分析，使用GraphPad Prism 8软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANONVA)，用Duncan’s 多重比较法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 DhGMDS基因的克隆

为了获得DhGMDS基因的cDNA序列，以霍山石斛总RNA反转得到的cDNA为模板，DhGMDS-F和DhGMDS-R为引物进行PCR扩增，得到的产物如图1的第1条带，约1 100 bp，测序结果显示，该基因的开放阅读框(ORF) cDNA序列为1 134 bp，编码377个氨基酸，DhGMDS基因GenBank登录号MW855573。 为了获得DhGMDS基因的gDNA序列，以霍山石斛的基因组DNA为模板，采用特异性引物DhGMDS-F′和DhGMDS-R′进行PCR扩增，得到的产物如图1的第2条带，约1 500 bp,经测序表明该基因的gDNA序列为1 523 bp，其GenBank登录号MZ439829。与该基因的cDNA序列比较，发现DhGMDS基因无内含子，只有1个外显子。

2.2 DhGMDS蛋白的特征分析

霍山石斛DhGMDS蛋白相对分子质量为42.04 kD，包含377个氨基酸，蛋白分子式为C1867H2887N527O561S11，原子总数为5 853，等电点6.54，该蛋白不稳定系数为43.88，预估的半衰期在体外哺乳动物的网织红细胞是30 h、酵母体内大于20 h、大肠杆菌体内大于10 h，脂肪族指数76.10，总平均亲水性为-0.423。跨膜区分析显示该蛋白的1～377个氨基酸未形成跨膜区结构域，属非跨膜蛋白。

霍山石斛DhGMDS蛋白亚细胞定位预测结果表明：该蛋白定位于细胞质的可能性最大，为52.2%；定位于细胞核和线粒体可能性分别为34.8%和13.0%。

蛋白质二级结构域预测显示，约有36.87% 的氨基酸(139个)以α螺旋形式存在，13.53% 的氨基酸(51个)为延伸主链，49.60% 的氨基酸(187个)为无规则卷曲，表明该蛋白二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。用SWISS-MODEL对DhGMDS蛋白的氨基酸序列进行三维结构预测，经该软件数据库比对，将与数据库中相似度最高的1n7h.1.A建模[24]，GMQE(global model quality estimation，全局模型质量评估)值为0.83，该预测模型可靠，结果如图2所示其结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主，与二级结构预测相符。

2.3 一致性分析及进化树的构建

采用DNAMAN软件对霍山石斛等 7 种植物的GDP-甘露糖 4,6-脱水酶氨基酸序列进行多重比对分析。结果(图3)显示，霍山石斛的 DhGMDS与黄花石斛 (Dendrobiumcatenatum, LOC110093839)、小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsisequestris, LOC110020353)、油棕(Elaeisguineensis, LOC105054659)等物种的GMDS氨基酸序列一致性较高，在79.00%～99.03%之间。

将DhGMDS基因的核苷酸序列在NCBI上进行同源搜索，选取霍山石斛DhGMDS与马来西亚蕉(M.acuminatasubsp.malaccensis)、水稻(Oryzasativa)、盾叶薯蓣(D.cayenensissubsp.rotundata)等12种植物的GMDS核苷酸序列进行多重比对。结果 (图4) 表明，霍山石斛的DhGMDS基因与黄花石斛、小兰屿蝴蝶兰的GMDS基因聚为一类，其亲缘关系近。

2.4 DhGMDS基因启动子的克隆及元件分析

依据克隆的DhGMDS基因cDNA序列，设计3条特异性引物SP1、SP2和SP3(表1)，采用染色体步移的方法，克隆到DhGMDS基因5′端上游启动子区1 071 bp(图5)，DhGMDS基因启动子GenBank登录号MZ363640。由Plant CARE在线软件[27]分析结果可知 (表2)，在DhGMDS基因上游启动子区含有基本元件 CAAT-box 和 TATA-box，光响应顺式作用元件G-box和Box-4，与干旱、低温胁迫相关的响应元件MYC、LTR等。此外，还有与转录因子MYB结合位点有关顺式作用元件。

2.5 DhGMDS基因表达的qRT-PCR分析

对霍山石斛根、茎、叶、花中DhGMDS基因的相对表达量进行分析，结果(图6，A)显示，DhGMDS基因在不同部位均有表达，在花中相对表达量较高，其次是茎和叶，在根中的表达量最低，可推测DhGMDS基因为花中特异表达的基因。

对霍山石斛整株植物进行低温处理，分析DhGMDS基因低温响应情况。结果(图6，B)表明，在低温胁迫过程中，DhGMDS基因相对表达量迅速上调，后稍有下降，在低温处理24 h时表达量最高。

3 讨 论

多糖是霍山石斛主要活性成分，目前对霍山石斛多糖的研究多集中在药理、药效方面[28-29]，从分子角度解析霍山石斛植物体内多糖合成途径尚无相关的深入研究。本研究以霍山石斛转录组数据为基础，克隆霍山石斛关键酶基因DhGMDS，为进一步研究DhGMDS基因在霍山石斛多糖代谢中的分子调控机制提供理论基础。系统进化分析显示，DhGMDS蛋白与兰科的黄花石斛、小兰屿蝴蝶兰聚为一类，说明DhGMDS基因序列在兰科中的保守性相对较高，在基因进化中不属于活跃型。实时荧光定量PCR分析显示，DhGMDS基因在花中相对表达量较高，其次是茎和叶，在根中的表达量最低。然而通常认为茎是霍山石斛主要的药用部位，这说明在药用植物中含有主要有效成分的组织部位，其DhGMDS基因的表达量不一定高，该基因在霍山石斛中的表达存在组织特异性。

启动子在基因表达调控中发挥重要作用，是RNA聚合酶识别、结合，并启动下游基因进行转录的DNA序列[30]。DhGMDS基因启动子的顺式作用元件分析表明，其启动子区除了含有基本元件，还含有多个逆境响应元件，如激素响应元件(脱落酸、水杨酸、乙烯)、低温响应元件、干旱响应元件，推测DhGMDS基因可能参与植物逆境响应过程。有报道指出，白桦BpTCP7基因启动子序列中具有低温、干旱、激素响应等相关顺式作用元件，进一步分析发现该基因参与逆境胁迫应答[31]。茶树CsLEA5基因启动子序列中包含与低温、干旱等多种逆境响应相关的顺式作用元件，分析发现该基因在低温、干旱中发挥重要作用[32]。蔡国强等[12]采用 RNA-Seq 技术对高盐胁迫下的发菜样品进行转录组测序，发现相比较正常培养条件， GDP-甘露糖 4,6-脱水酶基因在0.3 mol·L-1盐浓度下转录水平提高了2.18倍，且多糖含量明显增加，表明GDP-甘露糖 4,6-脱水酶基因在发菜响应盐胁迫过程中发挥了重要的调节作用。本研究qRT-PCR结果显示，DhGMDS基因在低温胁迫下显著表达，胁迫24 h的相对表达量最高。由上可推测DhGMDS基因参与植物逆境响应过程。

DhGMDS基因启动子中还含有 MYB转录因子识别位点, 大量研究证明MYB转录因子被认为是调节初级和次级代谢、防御和应对非生物胁迫及信号转导的关键因子[33]。也有研究表明，苹果中MdMYB88 和MdMYB124 通过CBF依赖和非依赖的信号途径调节低温应答基因的表达，从而增强苹果的低温抗性[34]，表明DhGMDS基因表达可能受 MYB转录因子的诱导。因此，推测低温胁迫对霍山石斛DhGMDS基因的诱导表达可能依赖于上游的MYB转录因子的调控，其具体的调控机制如何，还有待进一步研究。

综上所述，本研究克隆获得了霍山石斛DhGMDS基因及其启动子序列，并对其进行生物信息学分析和低温胁迫应答分析，为进一步研究DhGMDS基因的功能，解析霍山石斛抗寒机制和遗传改良提供理论依据。