相启森，董闪闪，范刘敏，马云芳，白艳红

（郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，食品生产与安全河南省协同创新中心，河南 郑州 450001）

紫外线（ultraviolet，UV）是一种波长位于可见光和X射线之间的不可见光，其波长范围为100～400 nm。根据波长的不同，可将紫外线进一步分为UVA（315～400 nm）、UVB（280～315 nm）、UVC（200～280 nm）和真空UV（100～200 nm），其中UVC波段能量较高，杀菌效果最强，已被广泛应用于饮用水消毒及新鲜农产品、果汁和肉类等的杀菌保鲜[1-2]。目前，传统紫外光源主要为汞灯、氘灯、氙灯和无极灯等，普遍存在能耗高、使用寿命短、汞污染和热辐射等问题。紫外发光二极管（ultraviolet light-emitting diodes，UV-LEDs）是一种新型的紫外发射光源，具有寿命长、绿色环保、效率高等优点，可替代传统紫外光源，在食品工业领域具有广阔的应用潜力[3]。

食品接触材料是指将要与食品直接、间接或可能接触而本身不构成食品的一类材料，主要包括塑料、金属、纸与纸板、玻璃、陶瓷等。在食品加工流通过程中，食品接触材料极易引起微生物入侵，进而与食品发生交叉污染[4]。Gounadaki等[5]在研究香肠加工过程中刀具、案板和绞肉机等微生物污染情况中发现，单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙门氏菌（Salmonellaspp.）和金黄色葡萄球菌（Staphylococus aureus）的检出率分别为11.7%、26.4%和11.7%。Lehto等[6]发现与鲜切蔬菜直接接触的设备表面总需氧微生物数量超过20 CFU/cm2。此外，Hutchison等[7]对畜禽屠宰场微生物污染情况进行了为期4 年的研究，发现传送带、托盘等极易受到微生物污染，平均需氧细菌总数为3.2～5.8 （lg（CFU/cm2））。因此，对食品接触材料进行杀菌消毒对于保障食品微生物安全具有重要意义。目前主要采用季铵盐类消毒剂、含氯消毒剂等进行食品接触材料表面消毒[8]。上述化学消毒剂虽然具有使用方便且性价比高等优点[4]，但其潜在的安全隐患受到广泛关注[9-10]。此外，热处理、超声波清洗也被用于食品接触材料表面消毒，但存在处理时间长、能耗高和成本高等问题[11]。紫外发光二极管（ultraviolet C light-emitting diodes，UVC-LEDs）技术已经在生鲜农产品采后贮藏保鲜、饮用水消毒净化等方面得到广泛应用[12]，但关于UVC-LEDs技术对食品接触材料表面微生物的失活作用及其杀菌动力学研究相对较少，影响其杀菌效果的因素尚不明确。

因此，本实验拟以常见的食品接触材料（304不锈钢片、玻璃片、牛皮纸和聚丙烯塑料薄膜）为研究对象，分别采用Geeraerd模型、Weibull模型和Biphasic模型研究UVC-LEDs失活其表面Escherichia coliO157:H7和L. monocytogenes的动力学规律；同时研究微生物种类和食品接触材料表面性质对UVC-LEDs杀菌效果的影响，以期为UVC-LEDs技术在食品接触材料杀菌中的实际应用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

大肠杆菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）（CICC 10907）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（ATCC 15313）购自美国标准菌种保藏中心。

304不锈钢片、玻璃片、牛皮纸和定向聚丙烯（oriented polypropylene，OPP）薄膜 郑州利研仪器设备有限公司；胰酪大豆胨（tryptic soy broth，TSB）液体培养基、胰酪大豆胨琼脂（tryptic soy agar，TSA）培养基、改良山梨醇麦康凯琼脂（cefixime tellurite-sorbitol macconkey agar，CT-SMAC）、改良山梨醇麦康凯琼脂添加剂、PALCAM琼脂、PALCAM琼脂添加剂1、PALCAM琼脂添加剂2 青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

UVC-LEDs装置 湖北深紫科技有限公司；LS125型紫外辐照计 深圳市林上科技有限公司；MULTISKAN GO型全波长酶标仪 美国Thermo公司；SW-CJ-1FD型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；TGL-16M型台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；OPTELICS C130型真实色激光共聚焦显微镜 日本Lasertec公司；OCA20型全自动接触角测量仪德国Dataphysics公司。

1.3 方法

1.3.1 食品接触材料预处理

将304不锈钢片、玻璃片、牛皮纸和OPP薄膜分别剪切成尺寸为2.5 cm×4.0 cm的样品。将304不锈钢片、玻璃片和OPP薄膜置于体积分数75%乙醇溶液中浸泡过夜以除去表面的微生物，用无菌水清洗3 次去除表面残留酒精，置于超净工作台中，25 ℃风干2 h备用；牛皮纸表面喷洒体积分数75%乙醇溶液后置于超净工作台中，采用紫外灯照射1 h，风干备用。

1.3.2 菌悬液制备

将E.coliO157:H7和L.monocytogenes菌种分别从－80 ℃冰箱中取出，在TSA培养基中活化两次，挑取一个单菌落接种于TSB培养基中，置于37 ℃、120 r/min培养12 h，4 000×g、4 ℃离心10 min，弃去上清液，所得菌体用0.85%无菌生理盐水洗涤2 次（离心条件同上），后用0.85%无菌生理盐水重悬至菌悬液浓度约为108CFU/mL，将制得的两种菌悬液等体积比混合至菌悬液浓度为107CFU/mL，备用[13]。

1.3.3 UVC-LEDs处理食品接触材料

1.3.3.1 接种

将上述制备的混合菌悬液100 μL（每次吸取10 μL，分10 次点接，单面接种）均匀接种于不同食品接触材料表面并涂抹均匀，置于超净工作台中，25 ℃风干2 h，使细菌完全附着于接触材料表面，备用。

1.3.3.2 UVC-LEDs处理

UVC-LEDs灭菌装置如图1A所示，发光面板（22 cm×22 cm）由64 枚UVC-LED灯珠组成（灯珠发射光谱见图1B，其最大吸收峰波长为275 nm）。采用紫外辐照计测量UVC-LEDs灯的照射功率，紫外照射剂量按照公式（1）计算。

将上述接种菌液的不同食品接触材料置于UVC-LEDs装置下进行处理，样品与UVC-LEDs灯的距离为15 cm，调节照射强度为1 mW/cm2，分别照射不同时间。

图1 UVC-LEDs实验装置示意图（A）和其发射光谱（B）Fig. 1 Schematic diagram of UVC-LEDs device (A) and emission spectrum (B) of UVC-LEDs

1.3.3.3 菌落计数

将上述经UVC-LEDs处理后的各组样品（每组样品为10 cm2的不同材料薄片）放入含有30 mL无菌生理盐水（0.85%）和无菌玻璃珠的50 mL无菌离心管中，漩涡振荡5 min使样品表面的细菌完全洗脱下来，取上述洗脱液进行10 倍梯度稀释，选择合适的稀释液100 μL分别涂布于PALCAM和CT-SMAC培养基中，用于L. monocytogenes和E. coliO157:H7的选择性培养。将涂布后的平板置于37 ℃恒温培养箱中避光培养。其中，E. coliO157:H7培养24 h进行菌落计数，L. monocytogenes培养48 h进行菌落计数。实验结果表示为lg（CFU/cm2）。每组样品均重复3 次[13]。

1.3.4 失活动力学模型建立

本实验中采用3 种常见的微生物失活模型（Geeraerd模型、Weibull模型和Biphasic模型）对UVC-LEDs杀菌效果进行拟合。

1.3.4.1 Geeraerd模型

Geeraerd模型按照公式（2）计算[14]。

式中：lg（N/N0）为UVC-LEDs处理后菌落总数降低的对数值；N0为样品的初始菌落数/（CFU/cm2）；N为UVC-LEDs处理后样品的菌落数/（CFU/cm2）；k为失活速率常数；d为杀菌处理剂量/（mJ/cm2）；p为耐受菌群占初始菌群的比例。

1.3.4.2 Weibull模型

Weibull模型如公式（3）所示[15]。

式中：lg（N/N0）为UVC-LEDs处理后菌落总数降低的对数值；N0为样品的初始菌落数/（CFU/cm2）；N为UVC-LEDs处理后样品的菌落数/（CFU/cm2）；b为尺度参数；d为杀菌处理剂量/（mJ/cm2）；n为形状参数；形状参数n反映灭活曲线的非线性程度，当n＞1时，曲线向上凸，曲线有肩峰；n＝1时，曲线是直线，为一级动力学模型；n＜1时，曲线向下凹，曲线“拖尾”。

1.3.4.3 Biphasic模型

Biphasic模型如公式（4）所示[16]。

式中：lg（N/N0）为UVC-LEDs处理后菌落总数降低的对数值；N0为样品的初始菌落数/（CFU/cm2）；N为UVC-LEDs处理后样品的菌落数/（CFU/cm2）；f为种群中对UVC-LEDs敏感的亚群所占的比例；1－f为种群中比f种群更具抗性的亚群所占的比例；kmax1为f种群的失活速率常数；kmax2为1－f种群的失活速率常数；d为杀菌处理剂量/（mJ/cm2）。

1.3.4.4 模型的可靠性评价

采用精确因子（accuracy factor，Af）、偏差因子（bias factor，Bf）、决定系数（R2）和均方误差（mean square error，MSE）4 个参数评价上述杀菌动力学模型的拟合程度[17-18]，其中，Af用来衡量预测值与实测值的接近程度。Af在1.0～1.9之间，模型可作为有效模型，当Af＝1，表明所有的预测值和实测值均相等，即Af越接近1，模型的可靠性越高；Bf用来评估实测值与预测值的偏差程度，Bf在0.90～1.05之间，模型可靠性较高，Bf在0.75～1.25之间，模型可被接受，Bf＞1表明预测值比实测值低，Bf＜1表明预测值比实测值高。R2和MSE用来评价模型的精确度，R2越接近于1，MSE越小，说明模型描述数据的拟合效果越好。计算如式（5）～（7）所示。

式中：n为实验组的个数；Nm为食品接触材料表面微生物数量的实测值/（CFU/cm2）；Np为食品接触材料表面微生物数量的预测值/（CFU/cm2）。

1.3.5 食品接触材料表面性质分析

1.3.5.1 表面粗糙度测定

采用OPTELICS C130型真实色激光共聚焦显微镜观察不同食品接触材料的表面形貌、测定其表面粗糙度[19]。本实验中所采用的视野范围为1 420 μm×1 140 μm。对每个样本的5 个位置进行测定，取平均粗糙度（roughness average，Ra）作为最终的测定值。

1.3.5.2 表面亲水性测定

水接触角（θ）是表征表面亲水性的常用指标[20]。采用Dataphysics OCA20型全自动接触角测量仪测定上述4 种食品接触材料的表面水接触角。采用微量进样器调整进样去离子水的体积，使在针头形成液滴，将水释放到样品表面。通过调节摄像系统使液滴显示清晰后，进行图像捕捉和接触角测量。每个样品均取5 个不同位置作为测试点，并取其平均值作为测试结果[21]。

1.4 数据统计与分析

所有数据结果均表示为平均值±标准差，每组数据做3 个平行。本实验中失活动力学模型使用Origin 8.0软件进行拟合，采用Prism软件绘图，采用SPSS 21.0软件进行ANOVA单因素方差分析和最小显著差异（least significance difference，LSD）法进行多重比较（P＜0.05表示差异显著）。

2 结果与分析

2.1 UVC-LEDs对食品接触材料表面致病菌的杀灭作用

如图2所示，UVC-LEDs对接种在4 种不同食品接触材料表面的E.coliO157:H7和L.monocytogenes的杀灭效果均随UVC剂量的增加而显著增强（P＜0.05）。当照射剂量为100 mJ/cm2时，玻璃片表面的E.coliO157:H7（初始接种量为4.80（lg（CFU/cm2）））便可被完全杀灭。而同样处理条件下，玻璃片表面L. monocytogenes数量降低了1.87（lg（CFU/cm2））（初始接种量为5.64（lg（CFU/cm2）））。当照射剂量为200 mJ/cm2时，OPP薄膜表面的E. coliO157:H7全部被杀灭，与对照组相比，OPP薄膜表面的L. monocytogenes降低了2.24（lg（CFU/cm2））。当UVC-LEDs处理剂量为800 mJ/cm2时，接种在玻璃片、OPP薄膜、不锈钢片和牛皮纸表面的L. monocytogenes分别从初始的5.45（lg（CFU/cm2））、5.56（lg（CFU/cm2））、5.11（lg（CFU/cm2））和5.47（lg（CFU/cm2））降低到0.60（lg（CFU/cm2））、0.70（lg（CFU/cm2））、1.04（lg（CFU/cm2））和5.08（lg（CFU/cm2））；牛皮纸表面E. coliO157:H7降低到3.60（lg（CFU/cm2））。

图2 UVC-LEDs处理对食品接触材料表面E. coli O157:H7（A）和L. monocytogenes（B）的影响Fig. 2 Effect of UVC-LEDs treatment on survival of E. coli O157:H7 (A)and L. monocytogenes (B) on food contact materials

以上结果表明，L.monocytogenes（革兰氏阳性菌）相较于E.coliO157:H7（革兰氏阴性菌）表现出更强的抗UVC能力。造成上述差异的原因可能是由于革兰氏阳性菌的细胞壁外部有一层较厚的肽聚糖结构，使紫外线更不容易穿透细胞[22]。在以前的研究中也有类似的发现，紫外线对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母、细菌孢子、真菌、病毒和原生动物的失活效能依次减弱[22-25]。

此外，UVC-LEDs的杀菌效果也受到食品接触材料性质的影响。如图2所示，UVC-LEDs对玻璃片表面E.coliO157:H7和L.monocytogenes的杀菌效果最好，其次是对不锈钢片和OPP薄膜，对牛皮纸的杀菌效果最差。王陈龙等[26]研究了脉冲紫外强光对玻璃片、塑料片和不锈钢片表面微生物的杀灭效果，发现在相同实验条件下（功率3 000 W、脉冲90 次、照射距离为60 cm），脉冲紫外强光对不锈钢载体上的枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的杀菌效果最好，对玻璃片和塑料片的杀菌效果次之。

2.2 UVC-LEDs杀菌动力学分析

2.2.1 Geeraerd模型

图3为UVC-LEDs处理后不同食品接触材料表面致病菌失活曲线的Geeraerd模型拟合结果，对应的拟和参数及模型检验因子数据见表1。各实验组的Geeraerd模型拟合参数R2最大为0.979（E.coliO157:H7、玻璃片），而玻璃片、OPP薄膜和不锈钢片表面L.monocytogenes失活模型的R2分别为0.583、0.743和0.813，均低于0.900。综合Af、Bf和MSE等评价参数发现Geeraerd模型不适用于描述UVC-LEDs对食品接触材料表面致病菌的失活规律。

图3 UVC-LEDs处理后食品接触材料表面E. coliO157:H7（A）和L. monocytogene（B）失活曲线的Geeraerd模型拟合Fig. 3 Geeraerd model fitting of the inactivation curves of E. coli O157:H7 (A) and L. monocytogene (B) on food contact materials after UVC-LEDs treatment

表1 Geeraerd模型的拟合参数和评价参数Table 1 Fitting and evaluation parameters of Geeraerd model

2.2.2 Weibull模型

采用Weibull模型拟合不同食品接触材料表面致病菌的失活曲线见图4，对应的拟合参数和评价参数见表2。从表2中可知，各组的模型决定系数R2均大于0.900，且OPP表面E.coliO157:H7的失活曲线拟合程度最高（R2为0.999），说明Weibull模型具有较高的拟合精度。Ringus等[27]也发现Weibull模型能够很好地反映脉冲强光对不同食品包装材料表面L.monocytogenes的失活规律。从图4和表2可知，模型的形状参数n均小于1，曲线下凹，出现“拖尾”。尺度参数b与灭活效果相关，牛皮纸、不锈钢片、OPP薄膜和玻璃片表面L.monocytogenes的失活曲线模型参数b值分别为0.014、0.130、0.240和0.308，其对应的杀菌效果依次增强。同样的，牛皮纸、不锈钢片、OPP薄膜和玻璃片表面E.coliO157:H7的失活曲线模型参数b分别为0.077、0.309、0.345和0.379，其对应的杀菌效果依次增强。

图4 UVC-LEDs处理后食品接触材料表面E. coliO157:H7（A）和L. monocytogene（B）失活曲线的Weibull模型拟合Fig. 4 Weibull model fitting of the inactivation curves of E. coli O157:H7 (A) and L. monocytogene (B) on food contact materials after UVC-LEDs treatment

表2 Weibull模型的拟合参数和评价参数Table 2 Fitting and evaluation parameters of Weibull model

2.2.3 Biphasic模型

Biphasic模型拟合UVC-LEDs对不同食品接触材料表面微生物致死效果的拟合曲线如图5所示，模型拟合参数和评价参数见表3。Biphasic模型对UVC-LEDs处理食品接触材料表面致病菌失活规律的拟合效果最好。除不锈钢、牛皮纸表面L.monocytogenes失活动力曲线的R2分别为0.985、0.960，其余各组动力学曲线的R2均大于0.990。Biphasic模型的平均R2达到0.989，与Geeraerd模型（平均R2为0.858）和Weibull模型（平均R2为0.967）相比拟合度最高。

图5 UVC-LEDs处理后食品接触材料表面E. coliO157:H7（A）和L. monocytogenes（B）失活曲线的Biphasic模型拟合Fig. 5 Biphasic model fitting of the inactivation curves of E. coli O157:H7 (A) and L. monocytogenes (B) on food contact materials after UVC-LEDs treatment

采用模型评价参数MSE、Af和Bf进一步分析上述3 种模型对UVC-LEDs杀菌效果的拟合度。由表1～3可知，Biphasic模型各组的MSE（0.016～0.001）和Af均低于Geeraerd模型和Weibull模型。且Biphasic模型的Bf（0.903～1.107）更接近1，说明该模型的可靠性较高。因此，Biphasic模型能够很好地拟合UVC-LEDs对食品接触材料表面致病菌的失活曲线。上述实验结果与之前的研究报道[28-29]一致。Lee等[29]采用Weibull模型和Biphasic模型研究UV-TiO2光催化技术对大肠杆菌K12在蓝莓和琼脂培养基表面的失活效果时也发现，Biphasic模型具有更高的R2和更小的MSE，该模型拟合效果更好。

从表3可知，UVC-LEDs对玻璃片、OPP薄膜和不锈钢片表面E.coliO157:H7杀菌时的f分别为0.995、0.991和0.990，说明在以上3 种材料中对UVC-LEDs敏感的微生物种群所占的比例无明显差异。其中，UVC-LEDs处理牛皮纸表面L.monocytogenes组的f值为0.330，明显低于其他处理组，表明牛皮纸表面抗UVC的L.monocytogenes种群所占比例最大[30-31]。从表3可知，所有实验组的Kmax1均大于Kmax2。以E.coliO157:H7为例，玻璃片、OPP薄膜、不锈钢片和牛皮纸组的Kmax1依次减小，分别为0.210、0.165、0.164和0.023，L.monocytogenes也有类似的实验结果。表明UVC-LEDs对玻璃片表面致病菌的杀菌效果最好、对牛皮纸的杀菌效果最弱。

表3 Biphasic模型的拟合参数和评价参数Table 3 Fitting and evaluation parameters of Bisphasic model

以同一模型所有实测数据为横坐标，模型预测数据为纵坐标作图，衡量预测值和实测值的一致性，通过线性拟合得到决定系数R2，判断预测值和实测值的差异[32-33]。如图6所示，对于E.coliO157:H7和L.monocytogenes而言，Biphasic模型的决定系数R2均接近1，Biphasic模型的预测值和实测值之间的相关性最好，表明该模型拟合效果最好。

图6 UVC-LEDs对不同食品接触材料表面细菌的失活效果实测值和预测值的相关性Fig. 6 Correlation between observed and predicted data for inactivation of bacteria inoculated on food contact materials by UVC-LEDs

2.3 不同食品接触材料的表面粗糙度比较

表面粗糙度是表征材料表面不平整度的重要参数。研究发现，食品接触材料的表面粗糙度等性质显著影响热处理、有机酸等对微生物的杀灭效果[34-37]。玻璃片等4 种食品接触材料的激光共聚焦图像见图7。

由图7和表4可知，玻璃片、OPP薄膜、不锈钢片和牛皮纸的表面粗糙度Ra分别为0.53、1.09、1.19 μm和4.71 μm。结合图2可知，UVC-LEDs对食品接触材料表面致病菌的杀灭效果随其表面粗糙度的增大而降低。Adhikari等[38]发现，与表面粗糙水果（哈密瓜、草莓和覆盆子）相比，UVC对表面光滑水果（苹果和梨）表面E.coliO157:H7和L.monocytogenes具有更强的杀灭效果。这可能是因为粗糙的样品表面更易于细菌形成密集的堆积结构，保护了部分细菌免受UVC的照射[39]。

图7 玻璃片（A）、OPP薄膜（B）、不锈钢片（C）和牛皮纸（D）的激光共聚焦图像Fig. 7 Confocal laser images of glass (A), OPP film (B), stainless steel (C), and brown paper (D)

表4 食品接触材料的粗糙度和水接触角Table 4 Surface roughness and water contact angle of food contact materials

2.4 不同食品接触材料的表面亲水性比较

通过测定水接触角来评价玻璃等4 种食品接触材料的表面亲水性，结果见图8和表4。由图8可知，玻璃片、OPP薄膜、不锈钢片和牛皮纸的表面亲水性差异较大，其水接触角分别为41.95°、73.92°、88.74°和112.15°。通常认为水接触角大于65°为表面疏水性材料，小于65°为表面亲水性材料[40]。在本实验中，玻璃片为亲水材料，OPP薄膜和不锈钢片均具有疏水性，而牛皮纸的疏水性最大。上述结果表明，UVC-LEDs对食品接触材料表面微生物的杀灭效果随食品接触材料表面亲水性的增大而增强。Park等[41]研究了ClO2对农产品（胡萝卜、甘蓝、卷心菜、菠菜、苹果、西红柿、青椒）和食品接触材料（特氟龙、硅、橡胶、聚氯乙烯、304不锈钢和玻璃）表面E.coliO157:H7、S.Typhimurium和L.monocytogenes的杀灭效果。结果表明，ClO2杀菌效果与上述农产品和食品接触材料的水接触角呈负相关，且相比于表面粗糙度，表面亲水性对ClO2的杀菌效能影响更为显著。上述结果可能与表面亲水性影响细菌在材料表面的分布和附着有关[42]。但具体机制有待深入研究。

图8 玻璃片（A）、OPP薄膜（B）、不锈钢片（C）和牛皮纸（D）的水接触角图像Fig. 8 Water contact angle images of glass (A), OPP film (B), stainless steel (C), and brown paper (D)

3 结 论

本实验建立了UVC-LEDs处理对不同食品接触材料表面两种致病菌的失活动力学模型并初步研究了影响其杀菌效能的因素。研究发现，UVC-LEDs对不同食品接触材料表面E.coliO157:H7和L.monocytogenes均具有良好的杀菌效果，Biphasic模型（R2＞0.960）和Weibull模型（R2＞0.922）能很好地描述UVC-LEDs对上述两种微生物的杀灭规律。UVC-LEDs对接种于玻璃片、OPP薄膜、不锈钢片和牛皮纸表面E. coliO157:H7（革兰氏阴性菌）的杀菌效果明显优于L. monocytogenes（革兰氏阳性菌）。UVC-LEDs对不同食品接触材料的杀菌效果依次为玻璃片＞OPP薄膜＞不锈钢片＞牛皮纸；食品接触材料的表面粗糙度依次为玻璃片＜OPP薄膜＜不锈钢片＜牛皮纸；表面亲水性依次为玻璃片＞OPP薄膜＞不锈钢片＞牛皮纸。以上结果表明，UVC-LEDs对于不同食品接触材料表面的杀菌效果可能受到微生物种类和食品接触材料表面性质等因素的影响。因此，在实际应用过程中，应综合考虑食品接触材料表面性质及微生物种类，优化处理参数以达到更好的杀菌效果。