温静静， 董玉娟， 王大壮， 王世凯， 陈红芳

(1.潍坊市益都中心医院 病理科， 山东 潍坊 262500； 2.潍坊市益都中心医院 肝胆外科， 山东 潍坊 262500)

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一类死亡率较高的原发性肝癌，是起源于肝细胞的恶性肿瘤，对人类健康形成了极大威胁，寻找有效治疗方法的研究一直备受关注[1]。有研究发现，未经治疗的HCC会发生自发性癌细胞凋亡[2]，且恶性程度越高凋亡指数越大[3]，提示通过调控HCC组织的细胞凋亡可对HCC的治疗成为可能。研究认为，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可通过调控多种细胞信号通路介导了肿瘤组织细胞凋亡的发生发展[4-7]，葡萄糖调节蛋白78(GRP78)常常作为细胞发生ERS的标志，当ERS发生时，GRP78与内质网(ER)膜上3种跨膜蛋白解离而启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)等相关级联反应，诱导细胞凋亡[8]。Caspase家族成员被公认在细胞凋亡信号转导中发挥中心作用，尤其是Caspase3作为细胞凋亡执行者，其激活机制的研究对于调节细胞凋亡的发生有着重要意义[9]。Caspase12是特定于内质网外膜上的促凋亡分子，在发生ERS相关凋亡过程中，Caspase12活化是其核心环节之一[10]，本文研究ERS介导的HCC细胞凋亡过程中，Caspase3与Caspase12的表达水平的变化，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1一般资料 标本和临床资料来自医院病理分级为Ⅰ-Ⅱ级(高分化)、Ⅲ-Ⅳ级(低分化)HCC组织标本各25份，总共50份标本中随机选取25份HCC标本的癌旁组织(距病灶2 cm的组织)作为癌旁对照组，标本均为2018—2019年手术病人切除的组织，-80 ℃速冻保存。男29例、女21例，年龄33～78岁、平均62岁。相关标本采集及使用符合人体标本研究相关伦理学要求。

1.1.2主要试剂 GRP78、Caspase3、Caspase12抗体，免疫组化Envision二抗检测试剂盒、原位末端标记法(TUNEL)检测试剂盒、Millipore NC膜0.45 μm孔径均购自北京Bioss技术有限公司，SYBRGreen购自大连TaKaRa公司，Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液购自美国赛墨飞世儿科技公司，逆转录试剂盒购自加拿大富酶泰斯公司，GRP78、Caspase3、Caspase12和β-actin引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下见表1。

表1 不同目的基因引物序列Tab.1 Primer sequences of different target genes

1.2 研究方法

1.2.1肝组织病理学检查 肝组织采用10%福尔马林固定、乙醇脱水并进行组织石蜡包埋，苏木素-伊红染色后观察肝脏组织病理变化。

1.2.2TUNEL法检测肝组织中肝细胞凋亡 按照试剂盒说明书操作，在荧光显微镜下观察凋亡的细胞，以胞核发绿色荧光的细胞作为凋亡细胞，并计算凋亡指数。凋亡指数=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.2.3免疫组化检测肝组织中GRP78、Caspase3及Caspase12蛋白表达 组织标本常规脱蜡水化，去离子水孵育后，分别滴加GRP78、Caspase3及Caspase12抗体(浓度比均为1 ∶100)，4 ℃过夜，次日37 ℃二抗孵育0.5 h，DAB显色，苏木素复染，磷酸盐缓冲液处理作为阴性对照，计算阳性细胞百分比(N)，N=(n阳/n总)×100%。(n阳为显微镜下随机抽取5个视野观察胞浆黄染的细胞，n总为5个视野观察细胞总数)。

1.2.4Real-time PCR检测GRP78、Caspase3及Caspase12 mRNA表达 采用双股DNA结合荧光系统(SYBRGreen)，按Thermo K1622逆转录反应试剂盒规范操作，20 μL逆转录反应体系为总RNA 1.0 μg、5×PCR Buffer 4.0 μL、dNTP 2.0 μL、Oligod(T) 1.0 μL、RNase Inhibitor 1.0 μL、MMLV反转录酶1.0 μL、无RNA酶H2O补足体积，反应条件为25 ℃ 10 min、48 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min；25 μL Real-time PCR反应体系为2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、Cdna 2.0 μL、无RNA酶H2O 8.5 μL，反应条件为预变性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环。每个样本设置2个复孔，实验重复3次，mRNA的相对表达量以2-ΔΔCt表示。

1.2.5Western Blot法检测肝组织中GRP78、Caspase3及Caspase12 蛋白表达 将制备好的蛋白样品每孔加样 8.0 μL。膜孔径转膜，制作湿式转膜“三明治”；用封闭液(脱脂奶粉)室温封闭90 min，将鼠抗GRP78、Caspase3及Caspase12分别按照1 ∶800、1 ∶1 000、1 ∶1 000比例稀释，4℃孵育过夜，摇床速度20～30次/min。次日回收一抗，TBST洗膜，6 min×3 次，二抗稀释液稀释二抗，抗兔IgG抗体(1 ∶20 000)常温孵育60 min，采用ODYSSEY Fc imaging system显色，拍照。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 HCC组织病理学变化

HE染色显示，HCCⅠ-Ⅱ级组HCC癌细胞呈细梁索状排列，细胞轻度异型，胞浆丰富，轻度嗜碱性，胞核大，核浆比值增大，核仁明显，少量核分裂象；HCCⅢ-Ⅳ级组HCC癌细胞呈粗梁索状或杂乱排列，细胞异型明显，细胞核大、不规则，核分裂象易见，查见巨核或怪状核；癌旁组织肝细胞索排列规则。见图1。

2.2 细胞凋亡

TUNEL法检测各组标本的细胞凋亡情况，结果表明HCCⅠ-Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级组中细胞凋亡的数目明显增加，与癌旁对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 GRP78、Caspase3及Caspase12蛋白表达

免疫组化检测结果显示，GRP78、Caspase3及Caspase12蛋白主要在细胞浆中，HCCⅠ-Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级组标本中Caspase3及GRP78的表达较癌旁组织增多(P<0.05)；在癌旁对照、HCCⅠ-Ⅳ级、Ⅲ-Ⅳ级组中，Caspase12表达未见明显差异(P>0.05)。见图3、图4。Western Blot检测结果显示，与癌旁对照组相比，HCCⅠ-Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级组中GRP78、Caspase3蛋白表达增加(P<0.05)，而各组标本的Caspase12蛋白比较，差异无统计学意义 (P>0.05)。见图5。

2.4 GRP78、Caspase3及Caspase12 mRNA表达

结果显示，HCCⅠ-Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级组中Caspase3及GRP78 mRNA的表达水平较癌旁对照组织增多(P<0.05)；在各组组织中Caspase12 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

3 讨论

HCC因高发病率、高死亡率备受各学者关注，其发病机制与机体乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和脂肪性肝炎、酒精性肝炎等慢性炎症相关[11-12]。各种理化生物因素作用细胞后出现炎症及氧化应激损伤甚至对基因产生影响，进而直接或间接引发ERS[13]。ERS是一种信号反应通路系统，是细胞的一种保护机制[14]。生理状态下，内质网膜上的3类跨膜蛋白，即蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK) 、1型内质网转膜蛋白激酶(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)和活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)，与GRP78(BiP)结合，处于失活状态[15-16]；当发生ERS时，3条信号通路相继被激活。早期内质网应激是促生存响应，过强或持续时间过长的未折叠蛋白反应会促进增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达引起细胞凋亡[17-18]，除CHOP介导细胞凋亡外，JNK信号通路及Caspase12通路也可介导凋亡[19-20]，Caspase12是由ERS诱导细胞凋亡的调节蛋白，由内质膜转位到细胞质，对Casase9酶原进行切割以使之活化，进而顺序激活Caspase3等效应Caspasese[21-22]。关于HCC发生发展过程中受内质网应激介导，是否激活Caspase12诱导的细胞凋亡通路的研究少有报道。

本研究发现，无论高分化还是低分化HCC组织的细胞凋亡均明显高于癌旁组织，说明HCC的发生伴随有细胞凋亡的增加，与其他研究报道一致。同时，HCCⅠ-Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肝组织中GRP78 mRNA和蛋白表达与癌旁组织比较均有增多，表明在HCC组织细胞凋亡增加的同时，细胞发生了内质网应激也是增强的，因此说明ERS介导了HCC细胞凋亡的发生；而Caspase3在HCCⅠ-Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肝组织中mRNA和蛋白表达与癌旁肝组织比较有显著增高，并且HCC Ⅰ-Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肝组织中细胞凋亡比例随着恶性程度的升高而增加，从而进一步表明ERS介导HCC细胞凋亡是通过调节相关信号通路从而激活Caspase3执行细胞凋亡的可能。但本研究还发现，HCCⅠ-Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肝组织中Caspase12 mRNA和蛋白表达与癌旁肝组织比较无显著变化，提示人HCC细胞凋亡发生且Caspase3的激活是ERS介导Caspase12以外的信号通路进行的，与前期在动物模型水平研究发现有所不同[23]，结合其他研究报道分析，Caspase12作为ERS中启动凋亡程序的一种特异蛋白酶，在以啮齿类动物为代表的的其他动物体内表达发挥重要作用，而在人体中Caspase12可能因丧失其酶活性不能发挥信号转导调节作用[24-25]。因此推测人体HCC发生细胞凋亡过程中，作为核心环节的Caspase3活化是ERS介导Caspase12以外的信号转导途径所致。

综上所述，在HCC发生发展过程中，ERS诱导的细胞凋亡参与其中，并且是通过Caspase12以外信号转导途径激活Caspase3实现的，这为今后寻找有效调节细胞凋亡从而发挥治疗HCC的研究拓宽了思路，并提供了一定的理论依据。