樊晔，曹崇梅，方云，夏咏梅

江南大学化学与材料工程学院，合成与生物胶体教育部重点实验室，江苏 无锡 214122

1 引言

碳点(CDs)一般指尺寸小于10 nm或在其左右、具有准球形结构且能稳定发光的纳米碳，自2004年面世以来1，便因其具有荧光纳米点(fluorescent nanodots，以下简称FNDs)的性质而受到广泛关注。这是因为CDs不仅保留了碳基材料低毒性和生物相容性等特性，而且荧光可调性强、水分散性好、抗光漂性强以及表面易于功能化，因此在分析检测、细胞成像、药物传输、发光器件、光电催化、生物传感和癌症治疗等领域都显示应用前景2,3。采用自上而下法制备CDs是将宏观碳源如石墨、碳纳米管和炭黑等通过激光烧灼4、电化学法5及酸蒸汽切割6等方式裂解；自下而上法常以生物质小分子如蔗糖7、柠檬酸8和氨基酸9等为碳源，也用合成小分子10,11，经过脱水、缩聚和碳化等反应制备。若以天然大分子如蚕砂12、苹果13和红茶14等为碳源时则需要经过先自上而下(高温裂解)后自下而上(脱水、缩聚和碳化)的过程。此外，还出现利用小分子15或聚合物16适度交联制备的具有独特类聚合物碳氢链结构的CDs (聚合物点，PDs)，进一步丰富了CDs的结构，使其碳核结构不再局限于sp2杂化的石墨烯碎片、sp2和sp3杂化碳构成的碳纳米点3。虽然生物质碳源制备碳基FNDs的方法具有原料绿色化的优势，但是其过程的绿色化和可持续性受到质疑17，即因其化学反应的可控性差而导致原子经济性差和FNDs产率低7,18；还会因水/溶剂热条件而提高对设备的要求和带来安全问题；有些甚至需消耗大量酸碱、强氧化剂或有机溶剂等，因此增加后处理过程并使废弃物严重8,13。

本实验室前期用天然来源和生理有益的共轭亚油酸(CLA)自组装不饱和脂肪酸囊泡(ufasomes)，获得平均粒径在10-20 nm范围的纳米中空颗粒，并发现其本身或自交联体在药物缓释、钙离子响应性、提高耐酸性和冷水溶解度等方面显示应用潜能19-24。本文设想，如果进一步减少对上述自交联过程的干扰使其粒径更均一，以及提高自交联度使其更稳定，也许能构思一种生物质碳源经非传统(裂解-脱水-缩聚-碳化)途径“构筑”而非“合成”碳基FNDs的新策略，从而克服文献中各项缺陷，使生物质碳源法更趋向于生物和环境友好、有序和可控的绿色化学过程。文献中曾有零星报道在油酸和水不相溶体系中以乙酸碳源制备碳基FNDs25或以油酸为溶剂而蔗糖碳源制备碳基FNDs7，但鲜有用脂肪酸碳源制备碳基FNDs的报道。因此，本文将利用CLA的自组装活性获得分子有序排列的ufasomes，再引发其共轭双键聚合获得自交联的ufasomes(SCU)，从而用生物质小分子CLA为碳源经自组装-自交联全新策略直接制备自交联不饱和脂肪酸囊泡基FNDs(SCUFNDs)，并进一步考察该FNDs独特的表面羧酸基团和内部自交联度对其荧光特性的影响。

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

CLA (纯度≥ 95%)，购自大连医诺生物有限公司；过硫酸铵(APS，AR)，购于国药集团化学试剂有限公司，重结晶3次后使用；其它试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂公司。实验用水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)，美国Millipore Synergy UV超纯水系统。

JEM-2100透射电子显微镜(日本JEOL公司，加速电压120 kV)；FS5荧光光谱仪(英国Edinburgh Instruments公司)；TU-1950双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；ALV/DLS/SLS-5022F型激光光散射系统(德国Hosic有限公司)，PLUS-85冷冻干燥机(西班牙LYOQUEST公司)。

2.2 SCU的制备

配制氢氧化钠的无水乙醇溶液，在磁力搅拌下将其缓缓加入等摩尔量的CLA的乙醇溶液中，经皂化得到共轭亚油酸钠(SCL)，脱除溶剂后经真空烘箱干燥备用。用pH 8.6的硼酸(0.1 mol·L-1)-硼砂(0.025 mol·L-1)缓冲液准确配制3 mmol·L-1的SCL溶液，并取其10 mL于25 mL圆底烧瓶中，加入20 μL的APS水溶液(0.22 mol·L-1)，通氮气30 min排除氧气，然后将其置于80 °C的油浴中搅拌自交联10 h得到澄清透明无任何沉淀物的SCU溶液。以下光学性质实验中如无注明均直接使用该溶液作为SCU-FNDs溶液。

2.3 透射电子显微镜表征

用移液枪取10 μL的SCU-FNDs溶液滴于铜网(T10023，北京新兴百瑞技术有限公司)上，用滤纸吸干多余的液体，重复三次，自然干燥后进行透射电子显微镜(TEM)表征。

2.4 动态激光光散射表征

SCU-FNDs溶液经Millipore Millex-HV针筒式过滤器(水相，PVDF材质)过滤至样品瓶中，在波长632.8 nm，散射角90°，扫描时间300 s，25 °C下进行动态激光光散射(DLS)扫描，获得光散射强度数据并计算其相应的粒子半径(Rh)及平均粒径(D¯).

2.5 自交联度测定

SCU-FNDs溶液用pH 8.6的硼酸-硼砂缓冲液稀释至0.06 mmol·L-1后测定其紫外吸收光谱(UV)，根据CLA在234 nm处的吸光度(A)与浓度(c，mmol·L-1)之间的紫外吸收标准曲线(A= 25.351c-0.0009，R2= 0.9998)，判断SCU-FNDs中CLA分子的共轭双键自交联度DSC (DSC = (c0-c)/c0，c0为溶液初始浓度(mmol·L-1))。

2.6 FNDs产率测定

用超纯水准确配制3 mmol·L-1的SCL溶液，取50 mL于100 mL圆底烧瓶中，加入100 μL的APS水溶液(0.22 mol·L-1)，用HCl调节至pH 8.6，通氮气30 min排除氧气，然后将其置于80 °C的油浴中搅拌下自交联10 h得到澄清透明无任何沉淀物的SCU-FNDs溶液。用NaOH溶液调节至pH 8.6后用截留分子量3500的透析袋透析6 h，每隔2 h换一次透析液(超纯水)，冻干后计算FNDs产率y(y=w/w0，w为FNDs生成量即透析残留物量(mg)，w0为生物质碳源SCL的投料量(mg))。

2.7 光学性质测定

(1)光学吸收性质：将不同自交联度的SCUFNDs溶液用pH 8.6的硼酸-硼砂缓冲液稀释至0.06 mmol·L-1，测定其UV吸收光谱。

(2)荧光发射性质：在选定的激发波长下(如无特殊说明均为320 nm)测试各种SCU-FNDs溶液的荧光发射光谱。

(3)温度响应性：将SCU-FNDs溶液置于不同温度(25-85 °C范围内每间隔10 °C)下恒温30 min，测其荧光发射光谱，观察其温度响应性；循环升/降温实验过程同上。

(4)光漂白性：将SCU-FNDs溶液置于激发波长为320 nm的氙灯下照射60 min，每隔2 min采集一次荧光发射光谱，选取最大发射波长处的荧光强度绘制时间进程图，观察强化辐照条件下SCUFNDs的光漂白性；同时将SCU-FNDs溶液置于自然光下30 d，每隔3 d采集一次荧光发射光谱，选取最大发射波长处的荧光强度绘制时间进程图，观察自然光辐照下SCU-FNDs的长期光漂白性。

(5)耐盐性：将SCU-FNDs配制成系列NaCl浓度(0.1-1.0 mol·L-1)的溶液，测定其荧光发射光谱，选取最大发射波长处的荧光强度绘制盐度依赖性图，观察SCU-FNDs的耐盐性。

2.8 SCU-FNDs表面的氯金酸原位还原

在10个小玻璃瓶中分别加入5 mL的SCUFNDs溶液，避光条件下置于60 °C水浴中恒温30 min，迅速加入56 μL氯金酸溶液(10 mmol·L-1)并摇晃混匀后立即置于60 °C水浴中分别反应不同时段，反应完成后立即转移至冰箱(-18 °C)中冷却10 min终止反应，取出样品测定荧光发射光谱。

3 结果与讨论

3.1 SCU-FNDs的制备与表征

由于紫外辐照聚合引发剂如异丙基硫杂蒽酮(ITX)等自身具有荧光，会干扰后续考察SCU作为FNDs的荧光行为，而热聚合引发剂如APS等自身没有荧光，因此本文采用热聚合的方式获得SCU20。图1和图2用TEM、DLS和234 nm处的吸光度综合表征了SCU的自组装形貌、粒径分布和自交联度。图1a为SCU的TEM图，表明其具有中空形貌，符合脂肪酸在其pKa附近易于形成囊泡的特征22,24；图1b显示其平均粒径为17 nm左右；图1c中通过DLS获得的统计粒径为17.5 nm，与TEM的结果相吻合，该粒径适合FNDs的范围但该法不易得到粒径小于10 nm的FNDs；根据图2中SCU在234 nm处的吸光度计算得CLA的自交联度约为75%，其形貌能耐受电子轰击和pH变化21,22，因此足以使SCU颗粒稳定作为FNDs。图2插图中紫外光谱细节显示SCU在270 nm处有少许吸收，与CDs的π-π*跃迁相似26,27，归因于交联后产生了类似苯环的大π键；图2还显示在320 nm最佳激发波长下SCU的最大荧光发射为400 nm，插图照片表明其在365 nm紫外灯下呈蓝绿荧光，具有FNDs的荧光性质。另外，CLA碳源经自组装-自交联策略制备SCU-FNDs的原料利用率很高，反应液清澈透明无固废排放，不仅环境友好而且透析后FNDs产率仍高达73.9%。

图1 CLA的SCU的表征：(a)TEM图，(b)粒径分布图和(c)DLS图Fig. 1 Characterization of the SCU of CLA by (a)TEM and (b)the resultant size distribution, and (c)DLS.

图2 CLA的ufasomes和SCU的紫外、荧光激发(EX)和发射光谱(EM)(左插图为紫外光谱局部放大图，右为SCU在365 nm紫外灯下的照片)Fig. 2 UV absorption, fluorescence excitation (EX)and emission (EM)spectra of the ufasomes and the resultant SCU of CLA (The insets are close-up views of the UV spectra left and a photo of the SCU under 365 nm UV lamp right).

3.2 表面羧基对SCU-FNDs的荧光特性的影响

研究发现改变电化学蚀刻碳纤维的条件可以得到表面含氧量不同的CDs，其荧光特性受表面含氧量影响28；Ding等29通过色谱柱分离出不同发光特性的CDs，发现发光特性同样受CDs表面的含氧基团含量控制。自组装和自交联策略使得该法获得的碳基FNDs具有明确的分层结构，表面为CLA的羧基所覆盖，而内部由部分聚合的CLA的碳氢链有序但交联状排列。鉴于SCU-FNDs的内外分层结构特性，本文首先特别关注其富集羧基的特有表面结构对荧光性质的影响。在SCU-FNDs中加入氯金酸，利用羧酸的弱还原性19减少表面羧基含量，观察其对荧光强度的影响。图3a为不同还原时间下SCU-FNDs的荧光发射光谱，其最大峰值的时间进程如图3b所示。可以看出加入氯金酸反应5 min后SCU-FNDs荧光强度迅速降低，随反应时间延长而变缓并趋于稳定，这应该是还原反应减弱并终止所致。该结果表明SCU-FNDs的表面羧基含量与荧光强度有正相关性，启示我们可以进一步对SCU-FNDs进行表面元素掺杂改性，以获得不同荧光强度和荧光发射波长的改性SCU-FNDs，或探索用于各种金属离子检测和多功能传感材料12。

图3 HAuCl4还原SCU-FNDs的荧光发射光谱(a)及其最大峰值的时间进程图(b)Fig.3 Fluorescence spectra of the SCU-FNDs after reduction of HAuCl4 (a)and the relevant time course of the maximum fluorescence intensity (b)

3.3 自交联程度对SCU-FNDs的荧光特性的影响

研究发现某些具有π-共轭结构的分子的聚集行为可以限制分子内旋转(RIR)从而产生聚集诱导发光(AIE)现象30；而一些非π-共轭结构的聚合物在溶剂中的聚集体会产生荧光发射31,32；还发现非π-共轭结构的聚合物也可以通过适度交联增强PDs的荧光强度33,34；由于缺少相关数据，还未见研究碳骨架结构(如石墨烯或碳纳米管或碳黑)及刚性对CDs荧光特性的影响。

本文由CLA自组装得到的ufasomes中分子间氢键作用和疏水作用均会增强对囊泡壁层中CLA分子的限域作用从而导致AIE现象，图4a中ufasomes在365 nm紫外灯下有蓝色乳光证明了这一点，但不能排除乳浊度对体系荧光现象的影响。而图4a中SCU-FNDs在日光下为无色透明状，在365 nm紫外灯下发出明亮的蓝光，则归因于自交联过程通过共价键交联进一步增强限域作用或SCU的刚性，因而产生了类似于CDs的强荧光发射。为了排除图4a中乳浊度对ufasomes体系荧光现象的影响，在CLA可以大量形成ufasomes的pH区间(8.6 ± 1.0)精细调节pH值并测定其荧光发射光谱，由图4b可见以pH 9.0分界，低于9.0的体系出现一个尖刺的荧光发射峰，与插图上排照片中低于9.0的体系出现乳光相互印证，而下排照片在365 nm紫外灯下均发出微弱蓝光。因此如图4c所示，ufasomes有且仅有微弱荧光，其在较低pH值下突增的尖刺状发射峰系乳光增强的假象；而SCU体系在两种pH值下均呈现稳定的强荧光发射，因此认为是共价交联增强荧光发射(CEE效应)34。

图4 Ufasomes和SCU-FNDs的荧光性质比较：(a)pH 8.6下的光照照片；(b)不同pH下ufasomes的荧光光谱图(上方插图为日光下，下方为365 nm紫外灯下的照片)；(c)不同pH下ufasomes和SCU-FNDs的荧光光谱图Fig. 4 Comparison of fluorescence properties between the ufasomes and the SCU-FNDs: (a)Photos taken under different light resources at pH 8.6; (b)Fluorescence spectra of the ufasomes at different pH (the upper inserted photos in sunlight, and the bottom photos under 365 nm of UV lamp); (c)Comparison of fluorescence spectra of the ufasomes and the SCU-FNDs at different pH.

鉴于SCU-FNDs的内外分层结构特性，本文同时特别关注ufasomes经自交联后的有序碳氢链特有内部结构对其荧光强度的影响。图5a通过加大引发剂用量增大SCU-FNDs的自交联度，图5b，c发现荧光强度及最大峰值随引发剂用量增大而增大。这应该是自交联过程借助共价键增多而增强了SCU-FNDs的碳氢链骨架的刚性，进一步限制分子的振动弛豫，使得体系的非辐射跃迁减弱且辐射跃迁增强，从而产生了更强的荧光发射16,34。这一结果不仅对进一步改善SCU-FNDs类自组装FNDs的碳氢链骨架结构，从而改善其荧光特性有指导意义，而且可供探讨石墨烯或碳纳米管或碳黑等碳骨架刚性对CDs荧光特性的影响时参考。

上述实验结果表明，ufasomes结构对其中CLA分子的限域作用以及SCU借助共价键交联提高颗粒刚性均可以使具有碳氢链骨架的SCU-FNDs像普通碳骨架的CDs一样发光，这些作用对CDs荧光强度的影响按下述顺序降低：碳骨架＞碳氢链共价交联(CEE效应)＞＞碳氢链限域(AIE效应)；还表明SCU-FNDs的荧光特性随其表面羧基含量和自交联度的变化而变化。

图5 pH 8.6下引发剂量对SCU-FNDs的DSC及荧光性质的影响：(a)紫外图谱；(b)荧光图谱；(c)荧光强度与DSC关系Fig. 5 Influence of the dosages of initiator on DSC and fluorescence properties of the SCU-FNDs: (a)UV spectra;(b)Fluorescence spectra; (c)Relationships between fluorescence intensities and the DSC values.

3.4 SCU-FNDs的温敏性荧光特性

碳核态或非掺杂CDs一般不易具备温敏性荧光特性，然而我们预期自交联虽然使SCU-FNDs具有了一定的刚性，但其内部的长碳氢链仍保留了一定的链运动自由度，温度升高可能会加剧链运动使SCU-FNDs的刚性下降，从而导致荧光强度降低，并产生与掺杂CDs类似的温敏性荧光特性12。因此本文将进一步探究SCU-FNDs的荧光强度随温度变化的响应性。在图6a，b完成的一次25-85 °C间升/降温循环中，图6a表明SCU-FNDs的荧光强度随升温而不断降低至起始值的60.5%，图6b则显示了相反的降温规律；图6c表明单次升/降温循环中各个温度下的最大荧光强度均满足共同的线性回归方程：I/I0= -0.00977T+ 1.229 (T：25-85 °C，R2= 0.99)；图6d显示25-85 °C间进行多次升/降温循环获得的25和85 °C下的最大荧光强度各自基本相同(RSD值较小)。图6的实验结果共同说明SCUFNDs的荧光强度具有极好的温敏性以及单次/多次升降温循环的重现性，无需像掺杂CDs那样依赖其它外加元素提供明显的温敏性，因此在绿色安全温敏性碳基FNDs荧光探针方面显示应用潜能。

图6 SCU-FNDs的温敏性荧光特性：(a)升温过程和(b)降温过程的荧光光谱图；(c)一次升/降温循环中最大荧光强度-温度的线性回归；(d)多次升降温循环中25和85 °C相应的最大荧光强度重现性Fig. 6 Temperature-sensitive fluorescence characteristics of the SCU-FNDs: (a)Heating and (b)cooling fluorescence spectra; (c)Linear regression of the maximum fluorescence intensities and temperatures in one temperature cycle;(d)Reproducibility of the maximum fluorescence intensities respectively corresponding to 25 and 85 °C in multiple temperature cycles.

SCU-FNDs的形成机制如示意图1所示，说明本文以小分子生物质CLA为碳源，经过自组装和自交联策略而非传统(裂解-脱水-缩聚-碳化)途径，成功制得了颗粒稳定且粒径均一，具有蓝绿荧光发射特性的SCU-FNDs；该方法具有不用有机溶剂、酸碱和氧化剂，无需纯化过程以及无固废物，且FNDs产率高达70%以上等优点；因而使碳基FNDs制备更满足生物和环境友好、有序和可控的绿色化学过程的要求。

示意图1 自组装和自交联策略从CLA分子构筑温敏性SCU-FNDs的机理Scheme 1 Mechanism illustration for self-assembly and self-crosslink strategy to fabricate the temperature-sensitive SCU-FNDs from CLA molecules.

3.5 SCU-FNDs的光漂白性和耐盐性

将SCU-FNDs在激发波长为320 nm的氙灯下持续照射，每隔2 min测定一次荧光发射光谱，观察辐照时长对其荧光性质的影响即光漂白性。图7a的实验结果表明荧光强度随时长增加先略有降低(小于10%)后趋于平缓，荧光强度并无显著变化说明SCU-FNDs在强化辐照下具有良好的抗光漂白性；图7b表明在自然光照30 d周期内每隔3 d测定一次，荧光强度并无显著变化说明其长期抗光漂白性好。SCU-FNDs具有与文献报道的传统CDs相似的良好抗光漂白性并优于传统染料35，因此可长期保存使用。图7c中SCU-FNDs溶液的荧光强度在不同氯化钠浓度下均维持不变，说明SCU-FNDs具有良好的耐盐性，可在生理盐水环境中应用。

图7 SCU-FNDs的荧光稳定性：(a)短期(氙灯)和(b)长期(自然光)光漂白性；(c)耐盐性(a1-c1)为荧光发射光谱；(a2-c2)为最大荧光强度Fig. 7 Stability of fluorescence properties of the SCU-FNDs for photobleaching under light radiation by(a)xenon lamp (short term)and (b)natural light (long term); (c)NaCl tolerance (a1-c1)is the fluorescence emission spectra; (a2-c2)is the maximum fluorescence intensity.

4 结论

本文以生物质小分子CLA为碳源，利用其表面活性和聚合活性在pH 8.6时通过自组装和热交联得到颗粒稳定且粒径均一(17 nm)，具有蓝绿荧光发射的SCU-FNDs，开发了一条生物质碳源经非传统(裂解-脱水-缩聚-碳化)途径制备荧光FNDs的新途径。与其它用生物质原料制备CDs的报道相比，该过程具备以下生物和环境友好、有序和可控的绿色化学特征：以常温水相小分子有序自组装控制FNDs的粒径，故条件温和且低能耗，粒径可控性强；除加入APS外未引入任何有毒有害的试剂或溶剂，故生物相容性好；以共轭双键自交联反应为主，不包含裂解、脱水、缩聚或碳化等机理不明或不可控反应，故反应可控性和产物可控性强，原料利用率高及FNDs产率高达73.9%，故有利于大规模制备；无需分离纯化即可应用且无固废物排放，故环境友好。荧光性能实验结果显示SCUFNDs的最大激发波长为320 nm，其荧光强度随囊泡表面羧酸基团减少而减弱，随自交联度增大而增大，表明SCU-FNDs的荧光特性随其表面羧基含量和自交联度变化而变化，因而荧光特性具有可调性；同时独特的自组装-自交联结构使其荧光强度具有良好的温度线性响应性，符合I/I0= -0.00977T+1.229 (T= 25-85 °C，R2= 0.99)，因而在制备无掺杂的绿色安全碳基FNDs用作温敏性荧光探针等方面具有应用潜力；另外SCU-FNDs具有的中空结构还使其可能兼具荧光探针和药物传输系统(DDS)的双重功能。