高永胜，刘 娜，邵 国，闫少春，白 静

肾细胞癌是全球十大常发的癌症之一[1]，肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是其主要组织学类型，大约占所有肾细胞癌病例的75%，是导致肾细胞癌死亡的主要类型之一[2]。为了解ccRCC肿瘤发生发展过程中的分子变化，研究者对ccRCC组织基因组、表观基因组和转录组进行了研究分析，发现ccRCC是多基因引起的，包括各种肿瘤抑制基因的丢失、VHL基因的异常失调等变化[3-4]。因此了解ccRCC的基因表达变化，对于明确ccRCC突出的分子学表征有一定特征的价值和临床意义。高通量测序又被称为下一代测序，可用于筛选和鉴定通过转录组测序发现的可能的疾病治疗潜在靶点[5]。该研究利用ccRCC和癌旁组织，通过高通量测序找出差异表达的基因，利用生物信息学对数据进行分析，并通过实验进行部分验证，以期为ccRCC发病机制和治疗提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 材料RNAeasy mini kit试剂盒购于美国Qiagen公司；反转录试剂盒、蛋白BCA定量试剂盒购于美国Thermo公司；鼠源ATP5F1抗体(sc-514419)和鼠源β-actin(sc-47778)抗体购于美国Santa Cruz公司；PVDF膜购于美国罗氏生物公司；RIPA裂解液购于上海碧云天生物技术有限公司；引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1ccRCC样本 取包头医学院第一附属医院进行手术的ccRCC患者的样本，包括ccRCC组织和相应的癌旁组织，肿瘤组织病理检测证实均为第Ⅱ期的样本。患者年龄38～75岁，术前均未接受放疗或化疗，术后均经病理组织学检查确诊。排除有严重的急性感染或同时患有其他肿瘤的患者。本研究经包头医学院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。

1.2.2ccRCC的生物信息学分析 ccRCC组织和癌旁组织共两组样本送上海美吉生物医药科技有限公司进行mRNA表达的高通量测序，差异表达结果在美吉生物云平台(https://www.cloud.majorbio.com)进行生物信息学分析。

1.2.3实时荧光定量PCR 取50 mg ccRCC样本组织，使用RNAeasy mini kit试剂盒提取总RNA，并使用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit将其反转录成cDNA，使用ABI 7900实时荧光定量PCR仪和SYBR染料法检测各组ATP5F1和β-actin mRNA情况，根据2-ΔΔCt计算相对表达量。引物序列ATP5F1 F：5′-AGGTCCAGGGGTATTGCAG-3′，R：5′-TCCTCAGGGATCAGTCCATAAC-3′；β-actin F：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′,R：5′-GGTCATTGATGGCAACAA-3′。

1.2.4Western blot实验 使用RIPA裂解液提取ccRCC和癌旁组织的总蛋白质，使用BCA法检测蛋白质浓度，每组蛋白样品取10 μg加入聚丙烯酰胺凝胶各泳道中，5%浓缩胶19 mA电泳30 min，12%分离胶29 mA电泳3 h后，使用转膜仪400 mA转膜过夜，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，5%牛奶封闭1 h，将ATP5F1和β-actin一抗1 ∶1 000稀释，4 ℃过夜孵育，TBST清洗3次，山羊抗鼠二抗1 ∶1 000稀释孵育1 h，加入ECL发光并使用化学发光仪采集图像[6]。

2 结果

2.1 ccRCC的生物信息学分析与癌旁组织比较，ccRCC差异表达的基因有14 016个(图1)，其中表达升高的基因有1 421个，表达降低的基因有12 595个。通过KEGG对差异基因进行富集分析，有251个基因涉及癌症，其中非小细胞肺癌的52个，胶质瘤的58个，前列腺癌的70个，癌症胆碱代谢的71个(图2)。通过GO富集分析发现，差异表达基因涉及多条代谢通路，包括脂质氧化、乙酰辅酶A代谢等过程(图3)。

图1 ccRCC和癌旁组织基因差异表达火山图

图2 ccRCC和癌旁组织基因差异表达KEGG富集分析图

图3 ccRCC和癌旁组织基因差异表达GO富集分析图

2.2 ccRCC表达基因分析对ccRCC中高表达的基因进行分析，发现与癌旁组织比较增加2倍的有60个基因，其中涉及ATP代谢有40个(表1)。主要包括ATPase H+transporting V0 亚单位、ATP synthase peripheral stalk亚单位、ATP synthase membrane 亚单位、ATP synthase F1亚单位等。

表1 ccRCC中表达增加倍数前20的基因列表

2.3 ccRCC中ATP5F1表达情况由于ATP5F1有商业化的抗体，本研究通过检测ATP5F1对二代测序结果进行研究。利用实时荧光定量PCR对ccRCC组织和癌旁组织ATP5F1 mRNA表达水平进行检测(图4A)，利用β-actin作为内参。与癌旁组织比较，ccRCC的ATP5F1 mRNA相对丰度增加，差异有统计学意义(t=5.016，P=0.007)；利用Western blot对ccRCC组织和癌旁组织ATP5F1蛋白表达水平进行检测(图4B、C)。与癌旁组织比较，ATP5F1蛋白变化与mRNA相一致，且差异有统计学意义(t=7.229,P=0.002)。

图4 ccRCC组织ATP5F1 mRNA和蛋白表达水平

3 讨论

随着高通量测序技术以及生物信息学分析的飞速发展，通过大数据分析某些或某类基因在疾病中的作用，可以为疾病发生发展的分子机制和治疗评价等研究提供新的思路。癌细胞表现出氧化还原状态和代谢的改变，这些变化与线粒体有关，因为线粒体是活性氧生成和能量代谢的主要位置[7]。本研究利用二代测序技术对ccRCC和癌旁组织进行了研究，研究发现ATP合成酶相关的基因在ccRCC中高表达。

肾细胞癌是一种代谢性疾病，其特征是：参与氧敏感的代谢途径失调(VHL/HIF途径改变)；能量传感(Warburg位移增强脂肪生成；降低AMPK和三羧酸循环)和营养感应级联(AMPK-TSC1/2-mTOR和PI3K-Akt-mTOR通路的调节)[8]。本研究通过二代测序发现ccRCC与癌旁组织比较有14 016个差异表达基因，而高表达的基因中与ATP合成酶相关的有40个。本研究利用实时荧光定量PCR和Western blot对其中的ATP5F1进行了验证，结果显示ATP5F1在ccRCC中高表达。proteinatlas网站显示，877例肾癌患者中，ATP5F1A高表达的为655例，ATP5F1B高表达的为688例。ATP5F1B是ATP合酶，H+转运，线粒体Fo复合物，亚基B1，是核基因编码的线粒体蛋白[9]。Brüggemann et al[9]研究发现ATP合成酶表达改变与ccRCC患者的总生存率相关，可能是ccRCC患者预后的重要因素。而proteinatlas网站显示ATP5F1高表达的ccRCC患者5年和10年的生存率更高。研究[10]表明癌细胞与正常细胞不同，即使是在有足够氧气的情况下，它们主要通过糖酵解来代谢葡萄糖。索拉非尼是一种广谱多激酶抑制剂，被证明可有效治疗晚期肾细胞癌和肝癌，其作用机制是抑制电子传输链和ATP合酶的复合物Ⅱ/Ⅲ的活性[11]。到目前为止，关于ccRCC中电子传递链蛋白质亚基表达变化的报道和研究很少。因此通过二代测序发现电子传递链中的ATP合成酶基因表达上调，为阐明电子传递链在ccRCC中的作用提供了一个线索。

本研究通过生物信息学发现ccRCC患者样本有多种基因表达改变，其中ATP合成酶的多个基因表达显著上调。实验验证ATP5F1的变化与生物信息学分析结果一致，ATP5F1有6种亚单位，本研究只对整体的ATP5F1进行了验证。文献和生物信息学网站显示ATP5F1高表达的ccRCC患者5年和10年生存率更高，由于电子传递链基因在ccRCC发生发展和预后的作用尚不明确，需要通过以后的进一步实验找出电子传递链基因的变化在ccRCC发生发展以及预后的作用机制，为临床治疗ccRCC的治疗提供潜在分子靶点。