王军，邱荣英，郭玉，李铁健，张贵兰，张贵民*（1. 山东新时代药业有限公司，山东 临沂 27300；2. 国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 27300；3. 鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276005；. 山东省临沂市兰山区柳青街道社区卫生服务中心，山东 临沂 276005）

枸橼酸莫沙必利，化学名为4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[4-（4-氟苯基）-2-吗啉基]甲基}苯甲酰胺枸橼酸盐二水合物，化学结构见图1。该药是大日本制药有限公司开发的消化道促动力药，于1998年6月首次在日本上市。该药为第一个5-HT4受体激动剂，通过兴奋胃肠道胆碱能中间神经元及肌间神经丛的5-羟色胺受体，促进乙酰胆碱的释放，从而增强胃肠道运动，改善功能性消化不良患者的胃肠道症状，且不影响胃酸的分泌。另外其还可与其他药物联用，治疗反流性食管炎及由此引起的咳嗽。由于枸橼酸莫沙必利良好的疗效，其在临床应用越来越广泛。

图1 枸橼酸莫沙必利结构式Fig 1 Structure of mosapride citrate

目前对枸橼酸莫沙必利的研究主要集中在合成、临床疗效、制剂与代谢方面，对其手性分离也有报道。但关于其杂质研究方面的报道较少。近几年LC-MS联用技术在杂质谱分析中的应用越来越广泛，可对药物中存在的未知杂质进行结构推导。本文采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（UPLC-QTOF-MS）定性分析了枸橼酸莫沙必利中的6个杂质，可为其工艺优化与质量研究提供参考。

1 仪器与试药

1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色谱仪、G6540B四极杆-飞行时间质谱仪（美国Agilent公司），配有电喷雾离子源（ESI）以及MassHunter B.06.00数据处理系统。

枸橼酸莫沙必利（纯度：99.0%，企业A）；杂质2对照品（2-乙氧基-4-氨基-5-氯苯甲酸，批号：520190901F，纯度：99.9%）、杂质3对照品（4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[（4-苄基）-2-吗啉基]甲基}苯甲酰胺，批号：MSBL-G-180301Z，纯度：99.5%）、杂质4对照品（4-氨基-5-溴-2-乙氧基-

N

-{[4-（4-氟苯基）-2-吗啉基]甲基}苯甲酰胺，批号：MSBL-E-180201Z，纯度：99.9%）、杂质5对照品（4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[4-（3-氟苯基）-2-吗啉基]甲基}苯甲酰胺，批号：MSBLF-180301Z，纯度：99.2%）（山东新时代药业有限公司）；乙酸铵（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）；乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；水为自制超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱YMC-Triart C柱（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）；流动相：A为10 mmol·L乙酸铵水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序（0～5 min，15%B；5～10 min，15%～30%B；10～20 min，30%～90%B；20～21 min，90%～15%B；21～25 min，15%B）；柱温40℃；波长274 nm，流速0.3 mL·min；进样量5 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）源；正离子模式检测；扫描范围

m/z

50～800；毛细管电压4 kV；裂解电压55 V；锥孔电压40 V；雾化气温度：350℃；干燥气流速8 L·min。

2.3 供试品溶液的配制

称取枸橼酸莫沙必利样品适量，用流动相定量稀释至约1 mg·mL，取适量过0.2 μm滤膜，作为供试品溶液。

2.4 杂质对照品溶液的配制

分别称取杂质2、3、4、5对照品适量，用流动相稀释至约10 μg·mL，作为杂质对照品溶液。

3 结果与讨论

3.1 UPLC-Q-TOF-MS方法的优化

日本药典中检测枸橼酸莫沙必利原料药的方法使用柠檬酸盐水溶液与乙腈进行梯度洗脱分析，由于柠檬酸盐难以挥发，故无法进入质谱分析，故需选择挥发性流动相。笔者分别比较0.1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、10 mmol·L乙酸铵水溶液与乙腈进行梯度洗脱，发现10 mol·L乙酸铵水溶液与乙腈梯度洗脱时各杂质分离度较好；参考文献报道，本研究最终采用了ESI源，在正离子模式下进行样品分析，且各杂质具有较好的质谱响应值，有利于杂质的定性分析。

3.2 供试品溶液总离子流图

供试品溶液进入UPLC-Q-TOF-MS后，总离子流图见图2，按照出峰时间依次对杂质进行编号（1～6），主峰为莫沙必利。

图2 枸橼酸莫沙必利供试品溶液的总离子流图Fig 2 Total ion chromatogram of mosapride citrate

3.3 莫沙必利质谱信息

样品主成分莫沙必利的二级质谱图见图3，母离子峰

m/z

422.1652为[M＋H]峰，其二级质谱碎片为

m/z

198.0319，且

m/z

198.0319与

m/z

200.0291丰度比约为3∶1，表明其含一个Cl原子。结合文献报道，其裂解途径如图3所示，莫沙必利中连接A、B两部分的酰胺键断裂后，A部分形成了

m/z

198.0319碎片离子，该碎片可为杂质结构解析提供重要依据。

图3 莫沙必利的二级质谱图及裂解途径Fig 3 MS2 spectra of mosapride and fragmentation pathway

3.4 杂质结构解析

3.4.1 杂质质谱信息 6个杂质经过UPLC-QTOF-MS分析后，获得各杂质的精确分子量与二级质谱碎片，具体质谱信息见表1。结合杂质的精确分子量，利用MassHunter软件计算获得分子式，再结合二级质谱碎片信息对杂质结构进行解析，化学结构见图4。

表1 枸橼酸莫沙必利中杂质的质谱信息
Tab 1 MS information of impurities in mosapride citrate

No. 保留时间/min 母离子/（m/z） 分子式 误差/（×10－6） 碰撞能量/eV 碎片离子/（m/z）1 10.21 440.1752[M＋H]＋ C21H27ClFN3O4 1.14 15 198.0317；271.0844 2 12.02 216.0424[M＋H]＋ C9H10ClNO3 0.93 8 169.9999；198.0314 3 12.73 404.1746[M＋H]＋ C21H26ClN3O3 2.48 20 198.0316 4 14.17 466.1142[M＋H]＋ C21H25BrFN3O3 1.29 20 241.9813 5 14.66 422.1646[M＋H]＋ C21H25ClFN3O3 1.18 20 198.0316 6 15.25 367.1232[M＋H]＋ C18H20ClFN2O3 3.55 15 198.0321

图4 枸橼酸莫沙必利中杂质的结构式Fig 4 Structure of impurities in mosapride citrate

3.4.2 杂质结构解析 结合莫沙必利的裂解规律与杂质二级碎片离子对各杂质结构解析如下。

杂质1：二级质谱图见图5，母离子

m/z

440.1752 [M＋H]，经软件计算分子式为CHClFNO，比莫沙必利分子式多一分子HO。由于

m/z

198.0317碎片仍存在，参考莫沙必利裂解机制，该杂质含有A部分结构，因此判断B部分结构多了一分子HO。经软件计算碎片

m/z

271.0844离子组成为CHClNO，为母离子失去基团CHFNO生成；而

m/z

271.0844继续失去基团CHNO则生成碎片

m/z

198.0317。由此推断杂质1的结构与可能的二级断裂机制如图5所示。

图5 杂质1的MS2质谱图及可能裂解途径Fig 5 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 1

杂质2：二级质谱图见图6，母离子

m/z

216.0424 [M＋H]，经软件计算分子式为CHClNO，其中二级碎片含有

m/z

198.0314，说明含有A部分结构。由于母离子

m/z

216.0424比

m/z

198.0314多18 Da，可判断杂质2脱水生成碎片

m/z

198.0314，由此判断杂质2含有OH基团；碎片离子

m/z

169.9999为

m/z

198.0314脱去乙基形成的。由此推断杂质2的结构与可能的二级断裂机制如图6所示。通过与杂质2对照品对比，保留时间、母离子与二级碎片离子均一致，鉴定该杂质为2-乙氧基-4-氨基-5-氯苯甲酸。

图6 杂质2的MS2质谱图及可能裂解途径Fig 6 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 2

杂质3：二级质谱图见图7，母离子

m/z

404.1746 [M＋H]，经过软件计算分子式为CHClNO，比莫沙必利少一个F原子。其中碎片离子

m/z

198.0316存在，说明含有A部分结构，该部分为酰胺键断裂生成，由此可推断杂质3的结构与可能的二级断裂机制如图7所示。结合文献报道，并通过与杂质3对照品对比，保留时间、母离子与二级碎片离子均一致，鉴定该杂质为4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[（4-苄基）-2-吗啉基]甲基}苯甲酰胺。

图7 杂质3的MS2质谱图及可能裂解途径Fig 7 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 3

杂质4：二级质谱图见图8，母离子

m/z

466.1142 [M＋H]与

m/z

468.1111 [M＋H]丰度比约为1∶1，初步判断内含一个Br原子，经过软件计算分子式为CHBrFNO，与莫沙必利分子式相比，可判断Br原子取代了Cl原子；碎片离子

m/z

241.9813与

m/z

243.9810丰度比约为1∶1，可判断碎片内含一个Br原子，参考莫沙必利断裂机制，初步判断杂质4失去B部分基团生成该碎片。由此推断杂质4的结构与可能的断裂机制如图8所示。通过与杂质4对照品对比，保留时间、母离子与二级碎片离子均一致，鉴定该杂质为4-氨基-5-溴-2-乙氧基-

N

-{[4-（4-氟苯基）-2-吗啉基]甲基}苯甲酰胺。

图8 杂质4的MS2质谱图及可能裂解途径Fig 8 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 4

杂质5：二级质谱图见图9，母离子

m/z

422.1646 [M＋H]，经过软件计算分子式为CHClFNO，与莫沙必利互为同分异构体。由于存在碎片离子

m/z

198.0316，该基团为酰胺键断裂生成，说明含有A部分结构。结合合成工艺，初步判断为F原子位置异构，通过与杂质5对照品对比，保留时间、母离子与二级碎片离子均一致，鉴定该杂质为4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[4-（3-氟苯基）-2-吗啉基]甲基}苯甲酰胺，判断杂质5的结构与可能的二级断裂机制如图9所示。

图9 杂质5的MS2质谱图及可能裂解途径Fig 9 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 5

杂质6：二级质谱图见图10，母离子

m/z

367.1232 [M＋H]，经过软件计算分子式为CHClFNO。由于存在碎片离子

m/z

198.0321，说明含有A部分结构。碎片

m/z

198.0321为母离子失去基团CHFNO生成，参考“3.4.3”项下的合成路线，该基团与化合物Ⅲ分子式一致，由此判断杂质6的结构与可能的二级断裂机制如图10所示。3.4.3 杂质来源推测 根据文献报道，枸橼酸莫沙必利的合成路线如图11所示。结合表1中的杂质质谱信息与图11合成路线对各杂质来源推导如下。

图10 杂质6的MS2质谱图及可能裂解途径Fig 10 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 6

图11 枸橼酸莫沙必利合成路线Fig 11 Synthetic route of mosapride citrate

杂质1为化合物Ⅴ生成化合物Ⅵ过程中，两个OH未发生脱水缩合形成吗啉环，继续参与下一步反应，最终形成了该杂质；杂质2为枸橼酸莫沙必利酰胺键水解生成；杂质3结构上比莫沙必利少了一个F原子，初步判断为化合物Ⅱ（对氟苯甲醛）中含有部分苯甲醛杂质，苯甲醛参与合成反应最终生成了该杂质，该杂质已见报道；杂质4为化合物Ⅶ中含有部分溴代杂质（2-乙氧基-4-氨基-5-溴苯甲酸），该溴代杂质与化合物Ⅵ反应生成；杂质5为化合物Ⅱ中含有的间氟苯甲醛参与合成反应生成；杂质6为残余的化合物Ⅲ与化合物Ⅶ发生副反应生成。

4 小结

由于美国、欧盟的药品注册管理部门对杂质鉴定有严格要求，对药物中含量≥0.1%的杂质要求进行结构确证，鉴定结构后可为原料药的质量控制与合成工艺提供依据。由于TOF技术能准确测定样品的精确分子量，而且在全扫描和二级质谱分析过程中具有非常高的灵敏度，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法对枸橼酸莫沙必利中的6个杂质进行了定性研究，通过与杂质对照品对比，鉴定了其中4个杂质。需进一步优化工艺路线与存储条件，避免杂质的产生。本文可为枸橼酸莫沙必利的工艺优化与质量控制提供参考。