刘佳利，任 维,2，杨思进,2，汤 润，毛琳慎，税丕先*

1西南医科大学；2西南医科大学附属中医医院，泸州 646000

卒中是造成我国国民减寿的第一病因，严重危害国民健康，影响全民健康水平。随着社会经济的发展及国民生活水平的提高，脑卒中的发病率逐年上升且日趋低龄化。根据发病类型的不同，脑卒中又分为缺血性卒中与出血性卒中。缺血性卒中又名脑梗死，有数据表明，在我国缺血性卒中人群约占卒中总人数的85%[1]。因此，如何减少脑梗死发病率、致残率、死亡率、恢复神经功能是目前中西医学者共同关注的难点和热点。

目前，西医对脑梗死的治疗手段主要为静脉溶栓、动脉溶栓和机械取栓三种，能为患者短期内重建病灶血运、缓解缺氧损伤、减少自由基产生等做出积极贡献[2]。但部分患者远期预后较差，面临后遗症、并发症等问题。中医药治疗脑梗死具有其独特的优势，其适用范围广、副作用小、患者预后好并能提高神经功能恢复、降低病残率与复发率、提高患者生活质量。中医认为脑梗死病因病机与气虚血瘀、痰瘀阻窍等有关，随着对中风及“毒邪”的深入认识与研究，有学者提出了“中风热毒论”“毒损脑络”等观点，认为中风后产生的痰毒、热毒等均可损伤脑络[3]。大血藤为木通科大血藤Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd.Et Wils植物的干燥藤茎，具有清热解毒、活血通经、祛风除湿等功效，并含有丰富的化学成分，如皂苷类、蒽醌类、有机酸类、木质素类、酚类等。常用于治疗肠痈腹痛、热毒疮疡、经闭、痛经、跌扑肿痛、风湿痹痛等[4]。现代药理学研究表明，大血藤能改善脑海马和皮质区的损伤，可抑制微循环灌注量的下降从而减小梗死区域面积占比，降低死亡率[4]。大血藤总酚酸可抑制脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织炎症反应、抑制脑细胞凋亡，同时，可降低脑缺血再灌注损伤大鼠的死亡率、降低神经功能缺失评分[5]。通窍化栓方是临床治疗脑梗死的有效组方，其中大血藤为君药，该方主治功能核心为祛风、祛痰、祛瘀。Cai等[6]临床研究结果表明，通窍化栓汤可明显改善缺血性脑卒中患者的血液流变学指标，可改善血液的黏稠度、凝固性及细胞聚集性，具有理想的抗栓作用。目前，对于大血藤作用于心脑血管疾病的有效成分、作用靶点、作用通路等仍处于探索阶段，使得研发利用及临床推广受到了一定限制。因此，本研究拟在前期研究基础上，进一步分析大血藤的化学成分，阐明其有效成分作用于脑梗死疾病的治疗靶点及作用通路，为深入研究大血藤治疗脑梗死提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Ultimate 3000超高效液相色谱仪(含自动进样器、柱温箱、在线真空脱气机、低压四元梯度泵、PDA检测器)，美国Waters公司；LTQ Orbitrap velos pro高分辨质谱仪，美国Thermo Fisher公司。大血藤饮片购自四川金方生物医药科技有限公司，批号：170987，产地：四川。表儿茶素、红景天苷(纯度均>98%)购自赛百草科技有限公司(北京，中国)，批号SH19052904、19042901；甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵(HPLC级)，美国Thermo Fisher Scientific公司；超纯水，美国Millipore 公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 大血藤提取物溶液制备

中药大血藤，经西南医科大学中药学教授税丕先鉴定为正品。大血藤粉碎，过3号筛。取粉末10 g，加8倍量无水乙醇，超声提取0.5 h(250 W，40 kHz)，冷却至室温，12 000 r/min离心10 min，重复两次提取操作，合并上清液A。滤渣加10倍量水超声提取1 h(250 W，40 kHz)。冷却至室温，12 000 r/min离心10 min，重复提取两次，合并上清液B备用。上清液A、B合并，旋转蒸发浓缩，冷冻真空干燥，获得大血藤提取物。精密称取大血藤粉末1 g，置于25 mL锥形瓶中，加入75%甲醇20 mL，精密称定，超声提取1 h，冷却后用75%甲醇补足减失重量，摇匀。以0.22 μm微孔滤膜滤过，得供试品待测液。

1.3 标准品溶液制备

精密称取表儿茶素、红景天苷标准品溶液各1.00 mg，分别置于5.00 mL量瓶中，加适量甲醇稀释，定容至刻度，配成浓度为200 μg/mL的标准品储备液。检测前用甲醇稀释储备液10倍，待测。

1.4 色谱条件

色谱柱：HSS T3柱(1.8 μm，2.1 mm ID × 150 mm，Waters)；35 ℃柱温；样品盘温度4 ℃；流动相A：水(含0.1%甲酸)；B：乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脱条件：0～5 min，2% B；5～8 min，2%→20% B；8～45 min，20%→55% B；45～52 min，55%→100% B；52～58 min，100% B；58～58.5 min，100%→2% B；58.5～65 min，2% B；进样量3 μL，流速0.2 mL/min。

1.5 质谱条件

对于高分辨质谱LTQ Orbitrap质谱仪，电喷雾(ESI)离子源参数设定如下：负离子扫描和正离子扫描模式，加热器温度为300 ℃，毛细管温度为350 ℃，毛细管电压为35 V，喷雾电压为± 3.5 kV，鞘气(N2)流速为35 arb，辅助气(N2)流速为10 arb；样品一级质谱分别在正负离子模式下进行全扫描(分辨率R为60 000，m/z扫描范围为100～1 500)，二级质谱采用数据依赖性扫描(data dependent scan，DDS)。数据采集和分析采用Xcalibur，Mass Frontier 7.0软件。

1.6 预测大血藤活性成分的靶点

利用中药分子机理生物信息学分析工具(Swiss Target Prediction)，针对鉴定出的大血藤活性成分进行靶点的预测计算与匹配，选择Probability≥0.05的靶点作为候选基因。

1.7 获得脑梗死的疾病治疗靶标

以“Cerebral ischemia”“Cerebral infarction”等相关词段为关键词和搜索条件，在2个疾病靶点数据库(OMIM数据库，http://www.omim.org/；GeneCards数据库，https://www.genecards.org/)中进行检索，检索出脑梗死疾病在数据库中的疾病靶点并去除重复基因，获得脑梗死疾病的蛋白靶点。

1.8 分析“大血藤-潜在靶标-脑梗死”蛋白质相互作用并构建拓扑网络

利用String数据库，将成分和疾病交集的靶标进行检索处理，物种设置为“Homo sapiens(人类)”，最低相互作用阈值设置为0.9，其余默认，得到靶标蛋白间的相互作用信息。将上述数据导入Cytoscape软件，构建“活性成分-靶点”网络，并使用其中的Network Analyzer计算拓扑参数，以betweenness centrality、closeness centrality、degree三个参数的中值为阈值以筛选大血藤治疗脑梗死的核心靶点。

1.9 识别功能模块、注释生物学信息、分析富集通路

利用DAVID数据库进行gene ontology(GO)与KEGG分析，根据P<0.05筛选得出排列前二十位的生物过程(biological progress，BP)、细胞成分(cell component，CC)、分子功能(molecular function，MF)及KEGG结果，并使用R语言软件进行结果可视化操作。

1.10 采用分子对接验证

选择相互作用网络中degree值靠前的5个靶点，选取其相应的化学成分，在Pubchem数据库中下载化合物结构，并从PDB数据库中获得所对应蛋白复合物的3D结构。利用软件Discovery Studio 2019中的CDOKCER方法，使用半柔性分子对接方法，导入蛋白及化合物结构后，使其能量最小化，并进行加氢、去水等操作，选取活性位点、去除原始配体，构建分子对接模型，并分析对接结果。以结合能(-CDOKCER interaction energy，-CIE)>0为界，值越大，提示二者间相互作用能越强。

2 结果

2.1 大血藤主要化学成分

将大血藤供试品溶液和标准品混合溶液按上述条件下的色谱及质谱条件进行UPLC-HR-MS分析，得到正、负离子模式下的总离子流图(typical total ion chromatograms，TICs，见图1)，响应均良好。利用Xcalibur Qual Browser软件，对正、负离子模式下采集的大血藤提取物进行分析，根据化合物正负离子模式下的高分辨质谱数据、同位素丰度、标准品比对确认，结合碎片信息、标准品裂解规律及已有文献报道，共鉴定及推测得到大血藤提取物中化合物共20种(见表1)，包括苯丙素类、蒽醌类、酚酸类、三萜类等。其中酚酸类12种，苯丙素类4种，蒽醌类3种，三萜类1种。20种化合物中，表儿茶素和红景天苷为通过对照品比对确认，有一级及二级碎片的13个化合物为根据其二级碎片及裂解规律及文献比对确认，没有碎片峰的5个化合物为根据其一级高分辨质谱数据、同位素丰度及与文献比对确认。

图1 正(A)、负(B)离子检测模式下的大血藤总离子流图Fig.1 TICs of Sargentodoxa cuneata in the positive(A) and negative(B) ion mode

表1 大血藤提取物UPLC-HR-MSn数据Table 1 UPLC-HR-MSn in the positive and negative ion mode data of the compounds detected in S.cuneata

续表1(Continued Tab.1)

2.2 大血藤化学成分筛选及靶点预测

共筛选活性化合物19种，包括酚酸类化合物如红景天苷、原儿茶酸、没食子酸、罗布麻宁、丁香酸葡萄糖苷，苯丙素类化合物如绿原酸、N-反式阿魏酰酪胺，蒽醌类化合物大黄素、大黄酚，甾体类化合物如胡萝卜苷，三萜皂苷类如齐墩果酸等。这些化合物有耐缺氧、抗炎等药理作用，提示筛选的成分与文献报道基本一致。并从Swiss Target Prediction数据库中共匹配预测到相关靶点393个。

2.3 疾病靶标的预测

通过OMIM及GeneCards两个数据库，共获得3 288个脑梗死疾病相关的靶点。

2.4 “活性成分-靶点”的构建及关键靶点的筛选

取上述两者的交集，作为大血藤治疗脑梗死的潜在靶点，输入至String数据库中，进行PPI网络分析(见图2)，得到266个蛋白、1 073条互作连线的蛋白网络，并将分析结果导入至Cytoscape软件中，构建大血藤的“活性成分-靶点”(见图3)，该网络由285个节点和908条边构成，红色“V”形为大血藤活性化合物，蓝色矩形为潜在靶点。并依据betweenness centrality、closeness centrality、degree三个参数，共筛选出核心靶点71个，包括PIK3CA、SRC、STAT3等。并按照degree对19种活性成分进行排序，发现二氢愈创木脂酸、大黄酚、紫罗兰酮苷、大黄素甲醚排在前列(见表2)。

2.5 GO富集分析

GO富集分析分为三个模块，即生物过程BP，MF和CC。BP显示靶基因主要集中在肽基酪氨酸磷酸化及自磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation、peptidyl-tyrosine autophosphorylation)、血小板激活(platelet activation)、上调细胞增殖(positive regulation of cell proliferation)、磷脂酰肌醇介导的信号转导(phosphatidylinositol-mediated signaling)、酪氨酸磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation)等(见图4)。

MF主要与α2-肾上腺素能受体活动(alpha2-adrenergic receptor activity)、生长因子受体结合(growth factor receptor binding)、血小板活化因子受体活性(platelet activating factor receptor activity)等有关(见图5)。

图2 核心靶点蛋白互作网络图Fig.2 The core target network of S.cuneata for cerebral ischemia

图3 大血藤化合物-靶点图Fig.3 “Ingredient-target network” of S.cuneata注：红色为大血藤活性化合物，蓝色为各个化合物对应的靶点。Note:The red section is on behalf of the S.cuneata compounds,the blue section represents prediction targets.

表2 排名前20大血藤治疗脑梗死的核心靶点拓扑信息Table 2 Topological information of the top 20 core targets in the treatment of cerebral infarction by S.cuneata

CC主要由分选内体(sorting endosome)、磷脂酰肌醇3-激酶复合物(phosphatidylinositol 3-kinase complex)、内体腔(endosome lumen)、伪足(pseudopodium)等组成(见图6)。

图4 核心靶点的GO-BP富集分析Fig.4 GO-BP enrichment analysis on core targets

图5 核心靶点的GO-MF富集分析Fig.5 GO-MF enrichment analysis on core targets

图6 核心靶点的GO-CC富集分析Fig.6 GO-CC analysis on core targets

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析发现，大血藤对脑梗死的药理作用涉及通路包括缺氧诱导因子-1(HIF-1)、神经鞘脂类(sphingolipid)、响应胰岛素、ErbB、FOXO、催乳素(prolactin)、雌激素(estrogen)等生物信号通路(按P值排序，见图7)。

图7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子对接验证

采用PIK3CA、SRC、APP、MAPK3、STAT3的分子对接模型与大血藤成分进行对接(见表3)，共对接22对。根据对接分值，选取排名前三进行分析。

3，4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷与APP主要以以下方式结合：与A链的GLY-11、THR-72、ARG-128、ILE-126、ASP-32形成氢键，与A链的LYS-107、PHE-108、SER-35、TYR-185形成碳氢键，与A链的TYR-71形成π-烷基键。紫罗兰酮苷与PIK3CA主要以以下方式结合：与A链的ARG-1770、SER-1774、ASP-1933、LYS-1776、LYS-1802形成氢键，与A链的MET-1772形成烷基，与A链的MET-1922形成二硫键。紫罗兰酮苷与STAT3主要以以下方式结合：与A链的ASP-181、ARG-221、ARG-254、ARG-24、ASP-48形成氢键，与A链的ILE-219、MET-258形成烷基(见图8)。

表3 小分子与靶点蛋白的分子对接结果Table 3 The docking result of small molecules with targets

3 讨论与结论

通过构建的网络图中对度值排名前5的成分：二氢愈创木脂酸、大黄酚、紫罗兰酮苷、胡萝卜苷、大黄素甲醚进行成分分析。二氢愈创木脂酸对血小板活化因子受体结合有阻断作用，从而防止血小板凝集造成血栓的形成[18]。大黄酚可能通过抑制Bax蛋白表达水平，减少Beclin1蛋白产生，减轻神经元凋亡，从而发挥神经保护作用[19]。胡萝卜苷神经保护作用与上调抗氧化蛋白，抑制P38丝裂原活化蛋白酶、应激活化蛋白激酶信号通路的活化有关。此外，有研究还发现，胡萝卜苷具有促神经干细胞增殖的作用[20]。大黄素甲醚可通过降低IL-1β、TNF-α、ICAM-1的表达，抑制Caspase-3的活性，从而减少神经细胞凋亡，发挥神经保护作用[20]。

图8 分子对接模型Fig.8 Molecular docking model注：A：绿原酸甲酯-APP；B：大血藤苷E-PIK3CA；C：大血藤苷E-STAT3。Note:A:3,4-Di-O-caffeoylquinic acid methyl ester-APP;B:Cuneataside E-PIK3CA;C:Cuneataside E-STAT3.

根据筛选出的71个核心靶点，并对PIK3CA、Src、STAT3、JAK2等degree值较大的靶点进行文献分析。PIK3CA是PI3K/Akt/mTOR途径的中心分子，与细胞增殖、血管生成和肿瘤发生有关。有研究表明，PIK3CA蛋白在OGD/R(氧糖剥夺/复氧诱导)的SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)和脑组织中的表达明显受到抑制，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，可有效提高PIK3CA表达水平从而减少线粒体介导的细胞凋亡，发挥神经保护作用[21]。星形胶质细胞(Src)是中枢神经系统中最丰富的细胞，在脑梗死发生后，其能激活成为反应性星形胶质细胞，并形成胶质瘢痕。有研究表明Src是Ang II诱导星形胶质细胞激活的上游信号，其中Src可激活ERK1/2来刺激星形胶质细胞的生长，在脑损伤过程中发挥重要作用[22]。JAK2/STAT3的激活与神经元凋亡密切相关。有研究表明，JAK2作为STAT3的上游信号分子，其能调节STAT3的磷酸化，从而介导STAT3激活的下游生物反应。JAK磷酸化抑制剂可降低缺血大脑组织中JAK2和STAT3磷酸化水平，从而降低细胞凋亡率，缩小梗死面积[23]。HSPs是因受有害刺激后细胞产生的一种应激蛋白，与肿瘤的产生、增殖及分化有关。有研究报道，HSP90α能在一定程度上保护缺氧神经细胞，并提高细胞耐缺氧能力，为半暗带内的血管再生争取了时间[24]。综上，预测的核心靶点参与了脑梗死的发病机制，分析结果与大血藤、脑梗死等相关报道较为一致，推测大血藤化学成分可通过作用于这些核心靶点，从而发挥潜在的治疗机制。

通过KEGG富集分析结果可知，大血藤可能通过HIF-1信号通路、sphingolipid信号通路、ErbB信号通路等发挥防治脑梗死的作用。其中HIF-1信号通路是调节细胞应对缺氧状态的主要分子，其在细胞低氧状态时较敏感[25]。目前已发现HIF途径可直接刺激活化近80种基因，其诱导的蛋白表达主要表现为提高缺氧细胞耐受力和存活力。Sphingolipid(神经鞘脂类)在神经生长分化过程中具有重要地位，外源性神经鞘脂类已被证实具有广泛的神经保护作用，其能发挥脑保护作用，并促进受损神经的修复等。有研究显示，静脉溶栓后配合神经鞘脂类注射液比单行静脉溶栓术的神经功能恢复更好。在衰老过程和神经退行性疾病的发展过程中，大脑中的神经酰胺水平会逐渐增加，并介导神经细胞凋亡，发挥修复作用[26]。NRG/ErbB信号通路在脑梗死的保护作用机制中发挥着重要作用，有研究发现，在受到创伤的大脑组织中，神经细胞里的NRG-1β及ErbB受体会被诱导。ErbB信号能拮抗中枢神经系统炎症的产生，保护大脑神经元。还有研究发现，针刺可以通过调节NRG/ErbB通路，提高ErbB的表达水平，在一定程度上抑制神经元的凋亡及炎症因子的释放与表达，还可抑制单核细胞浸润、星形胶质细胞活化后与细胞因子产生，从而发挥抑制炎症反应，保护神经元细胞的作用[27]。上述几条通路主要参与了氧化应激过程、神经修复、细胞凋亡、炎症反应等过程，可进一步推测大血藤化学成分可通过调节这些通路发挥治疗脑梗死的作用机理。此外，分子对接的结果，初步模拟了成分与靶点间的相互作用关系，在一定程度上验证了上述预测结果的可靠性[28]。

综上，本研究通过结合UPLC-HR-MS、网络药理学、分子对接等方法，对大血藤化学成分及治疗脑梗死的作用靶点、生物通路进行了研究与分析，构建了化学成分靶点间的相互作用关系并进行了验证。多方位阐释了大血藤通过多靶点、多通路机制发挥治疗脑梗死疾病的作用机制，且相关预测与文献报道相符，为未来深入研发大血藤治疗脑梗死的作用机制提供了基础与证据。