田海英 ,罗真真 ,汪琳琳 ,张 红 ,刘庆华△

山东第一医科大学第二附属医院:1.检验科;2.血液科,山东泰安 271000

染色体作为人类的遗传物质,是导致人类出生缺陷的重要原因之一,且目前尚无有效的治疗方法,只能依靠产前诊断达到预防染色体疾病的目的[1]。染色体微阵列技术(CMA)可实现全基因组水平检测染色体不平衡的拷贝数变异(CNV),尤其是对于染色体微缺失、微重复有更高的检出率,是染色体核型分析的有效补充[2]。已经有大量的研究证实,CNV 与许多疾病相关,包括数百种染色体的微缺失、微重复综合征,并且是先天性发育障碍的主要病因,包括自闭症[3]、智力障碍[4]、行为异常、肌张力减退等,严重影响患者的生活质量,给患者家庭带来沉重的精神和经济负担。CMA 在产前诊断领域应用的临床指征主要有高龄、无创DNA 检测(NIPT)高风险、夫妻一方染色体异常、B 超异常、不良孕育史等[5]。本研究分析CMA 在异常临床表现患者中的检测情况,为临床医生提供参考依据,从而降低出生缺陷,提高人口素质。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年2月至2020年12月在泰安地区部分医院产科、生殖医学中心、优生优育门诊就诊的287例孕妇为研究对象,年龄18～45岁,中位年龄31岁。孕妇均已签署知情同意书。因单纯高龄(≥35岁)、高龄合并NIPT 高风险、高龄合并超声异常以及高龄合并不良孕育史而进行羊水穿刺产前诊断的孕妇63例;因NIPT 高风险而进行羊水穿刺产前诊断的孕妇110例;因超声发现胎儿结构异常而进行产前诊断的孕妇47例;因不良孕育史而进行产前诊断的孕妇22例;因夫妻一方染色体异常而进行羊水穿刺产前诊断的孕妇18例;孕期服药、促排卵助孕、接触射线等其他原因进行羊水穿刺产前诊断的孕妇18例;因胚胎停育、B超确诊异常等原因导致流产进行流产组织CMA 检测的孕妇17例。同时选择儿科、康复科及新生儿科就诊的早产儿、高危儿、先天畸形及不明原因发育迟缓患儿共118 例为研究对象。患儿年龄4 h至15岁,所有患儿均抽取外周血进行CMA 检测,由其父母或监护人签署知情同意书。并进一步收集25例检测到致病位点的患儿父母外周血标本,进行CMA 检测,判断患儿的染色体异常片段是否来源于父母。

1.2 方法 排除介入性穿刺禁忌证后,在超声引导下进行羊膜腔穿刺术抽取30 mL左右的羊水,取适量用于CMA 检测。采集118例患儿的外周血2 mL,枸橼酸钠抗凝,应用QIAGEN 试剂盒提取基因组DNA。应用美国Affymetrix公司生产的CytoScan-HD(195万CNV 探针+75万SNP探针)芯片对样本进行检测。取流产组织绒毛或流产组织,检测前,流产物DNA 均经过与母血DNA的连锁分析排除母体细胞污染。

3种标本均采用Affymetrix公司配套检测试剂盒及优化的标准操作流程,使用CytoScanHD/Cyto-Scan750K 进行全基因组范围扫描。具体流程如下:(1)严格按照质控标准进行DNA 提取、酶切、连接、PCR、PCR 产物纯化、片段化、标记,再以染色体DNA探针实施全面覆盖,使之与支持物固定在一起后与标记分子进行杂交;(2)对DNA 杂交信号进行监测,通过相应的信息技术、CHAS软件对收集样本分子的数量以及序列信息进行检测;(3)得到的数据应用软件Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software进行分析结果,最终通过查阅DECIPHER、ISCA、OMIM、NCBI PubMed等数据库进行结果判读,评估染色体是否存在非整倍体异常、整倍体异常、微缺失、杂合性缺失异常等。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0对数据进行整理。计数资料采用百分数表示。

2 结果

2.1 CMA 检出的染色体异常类型分析 287例不同产前诊断指征的标本包括270例羊水穿刺标本和17例流产组织标本,CMA 共检出73 例明确致病的病例,包括64例羊水穿刺标本和9例流产组织标本;其中常染色体数目异常病例18例,常染色体致病性片段异常病例14例;性染色体数目异常病例29例,性染色体致病性片段异常病例11例;三倍体1例。在致病性片段异常病例中,小片段异常(1～10 Mb)病例12例,微小片段(<1 Mb)2 例,占比为19.2%(14/73),见表1。25例染色体异常但意义不明确的病例(VOUS),所占比例为8.71%(25/287),包括20例羊水穿刺标本和5例流产组织标本。

表1 CMA 检出的染色体异常类型分析(n=73)

2.2 CMA 在不同产前诊断指征中检出确诊病例的分析 根据羊水穿刺指征可以分为高龄、NIPT 高风险、夫妻一方染色体异常、B 超异常、不良孕育史、血清学筛查风险、高龄合并NIPT 高风险、高龄合并不良孕史和其他(包括孕期用药、接触射线等)等。经统计发现,CMA 检出确诊病例最多的产前指征为NIPT高风险,共检出异常病例45例,检出率为40.91%;其次为高龄合并NIPT 高风险,共检出确诊病例10例,检出率为76.92%。见表2。

表2 CMA 在不同产前诊断指征中检出确诊病例的分析

2.3 CMA 对不同类型CNV 患儿检测能力 对118例患儿进行CMA 检测,明确致病的病例有58例,检出率为49.15%;VOUS 共8 例,检出率为6.78%。所有阳性标本检测的CNV 类型分为染色体缺失(≥50 Kb)、染色体重复(≥10 Kb)、单亲二倍体(包括印迹染色体:染色体末端纯合片段>5 Mb或染色体中间纯合片段>15 Mb;非印迹染色体:染色体末端纯合片段>10 Mb或染色体中间纯合片段>20 Mb)、染色体缺失合并重复、非整倍体和嵌合体6类,见表3。在检测出染色体的片段中重复(≥10 Kb)的病例为18例,异常片段(1～10 Mb)的病例有30例,小片段(≤1 Mb)的病例有10例,检出率为17.2%。

表3 CMA 检测58例明确致病病例CNV 类型

2.4 118例患儿的临床表型及CMA 检测情况 按照临床表型分类进行阳性率的分析,结果显示,多表型患儿阳性率要高于单一表型患儿的阳性率,见表4。

表4 118例患儿的临床表型及CMA 检测结果

2.5 CMA 对25例染色体异常标本的遗传方式的检测情况 有25例检测到致病位点的患儿父母,通过采集患儿父母外周血标本进行CMA 检测,其中8例与患儿在相同区域发现染色体异常,为其再次生育提供了遗传风险咨询,以避免再次生育类似的患儿。有2例因CMA 不能检测平衡易位,故建议应用FISH或高分辨率染色体核型分析来确认患儿是否遗传自父母。见表5。

表5 25例染色体异常标本的遗传方式分类

3 讨论

在产前诊断和产后遗传病的检测中,CMA 具有分辨率较高的优势,而且相比于传统的染色体核型分析技术,优化了检测流程,不需要费时费力培养细胞,检测出微小片段的缺失和重复的概率较高[6]。然而,CMA 因无法检测出平衡性染色体重排,如易位等、倒位等具有一定限制[7],从而无法完全替代传统的染色体核型分析[8]。染色体异常不仅有数目的异常还有结构的异常,CMA 可检测出1～10 Mb的小片段以及小于1 Mb的微小片段CNV[9],是核型分析的有效补充,既可以提高染色体异常的检出率,避免缺陷儿的出生,又可以对再次生育进行遗传风险评估。

本研究结果显示,CMA 在羊水穿刺标本、流产组织标本以及外周血标本中,片段≤10 Mb的检出率较高,更能检测出微小片段的缺失和重复。本研究纳入的NIPT高风险标本数量占比最高,达到38.3%(110/287),且CMA检测出的确诊病例达到40.91%,尤其是高龄合并NIPT 高风险的检出率达到76.92%;其他临床指征中B超异常的确诊病例检出率为19.15%,对于发现异常胎儿或于孕期发现并明确诊断NIPT高风险病例具有重要的临床意义[10]。CNV 在其他研究中又被分为致病性CNV、可能致病性CNV 和VOUS[11]。VOUS是指不能明确该异常CNV的致病性[12],本研究中羊水标本VOUS总占比为8.71%,患儿外周血标本VOUS总占比为6.78%。国内相关的临床数据不足,需要更多的积累完善数据信息库调整报告阈值标准等方式来降低VOUS的比例[13]。随着芯片技术的不断发展,相信会有更多CNV的临床意义被明确。

自然流产大多是由于染色体异常所致[14],传统的检测手段如核型分析只能检测≥5 Mb的染色体异常,荧光原位杂交虽然不需要培养,但仅对特定的目标染色体的数目异常进行检测,全部的染色体难以实现精准定位。本研究共收集了17例流产组织标本,成功检测出明确致病标本9例,检出率达52.9%,其中染色体数目异常的有7例,包括1例22-三体、1例18-三体、1例16-三体等以及1例三倍体(69,XXY)。通过对流产组织标本进行相关检测,有利于寻找流产的原因,进而指导下一次的妊娠[15]。

CMA 检测适应证较为广泛,发育迟缓、智力低下,先天性畸形以及儿童孤独症等均适用于CMA 检测[16]。随着CNV的不断发展,越来越多的疾病,如癫痫、新生儿脑病、先天性心脏病等也被推荐为CMA检测的适应证[17-18]。

CMA 发展较快,它为研究基因复杂性提供了强有力的手段,结合传统的染色体分析技术,在临床诊断中的作用不断增强,值得推广应用。