杨滨泽,王爱明,李 飞,倪智妍

辽宁省铁岭市中心医院神经内科一病房,辽宁铁岭 112000

糖尿病是发生脑梗死的独立危险因素,该病与严重的代谢功能障碍及动脉粥样硬化风险增加有关[1]。因此,及时发现和控制大血管病变对预防和治疗糖尿病并发脑梗死(DMCI)具有重要意义。颈动脉内膜-中膜厚度(CIMT)的变化反映了动脉粥样硬化的严重程度[2],对动脉粥样硬化的诊断具有重要意义。据报道,修饰低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)对内皮细胞的损伤是动脉粥样硬化形成的早期关键事件,其中氨基甲酰化低密度脂蛋白(cLDL)不仅可引起人内皮祖细胞凋亡和加速衰老,还能刺激细胞黏附分子的表达和血管平滑肌细胞的增殖,这些不利的生物学效应多是由许多清道夫受体介导的,例如凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)[3]。可溶性LOX-1(sLOX-1)最近被认为是LOX-1膜近端胞外区蛋白裂解的产物,在冠心病或脑梗死患者中普遍升高[4]。然而关于上述因子与DMCI的关系尚不清楚,故本研究拟分析老年DMCI患者血清cLDL、sLOX-1水平变化以及与颈动脉狭窄和短期预后的关系,从而探索其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究是一项单中心前瞻性队列研究。共选取2018年4月至2020年10月本院收治的DMCI患者104例为DMCI组,其中男65例,女39例性;年龄60～89岁,中位年龄69岁。选择单纯2型糖尿病患者103例为DM 组,其中男58例,女45例;年龄60～88岁,中位年龄69岁。另外选择在同时期接受体检的100例健康者作为对照组,其中男60例,女40例;年龄60～89岁,中位年龄71.5岁。所有参与者均被告知并签署了知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会批准。纳入标准:DMCI组和DM 组的患者符合文献[5]中关于2型糖尿病的诊断标准;DMCI组患者同时还符合文献[6]关于脑梗死的诊断标准,并经头颅多普勒超声、MRI或CT 确诊;年龄≥60岁,有完整的临床资料。排除标准:合并严重肝肾功能不全、心源性脑梗死、心力衰竭、甲状腺功能不全、糖尿病肾病、自身免疫性疾病、严重感染或恶性肿瘤者;有认知障碍或精神疾病者;有1个月以上服用免疫抑制剂或抗炎药物者。纳入和排除标准适用于DMCI组和DM 组,且DM 组和DMCI组患者日常均口服降糖药物控制血糖,同时严格控制饮食。对照组人群排除任何血糖、血生化指标异常者。

1.2 方法

1.2.1 血清cLDL[3,7]、sLOX-1 水平的检测 在禁食>8 h后,采集受试者的空腹静脉全血标本5 mL,4 ℃环境下,以10 cm 为半径,1 450×g离心15 min后取上清液保存在-80 ℃环境下。采用夹心酶联免疫吸附试验测定血清cLDL、sLOX-1水平。其中sLOX-1使用市售试剂盒(上海江莱生物)进行检测,变异系数<10%。而血清cLDL 水平检测是利用兔抗人cLDL多克隆抗体(美国Biodesign公司)作为捕获抗体、山羊抗兔ApoB-辣根过氧化物酶抗体(美国Biodesign公司)作为二级抗体建立夹心酶联免疫方法完成的。将100 μL 兔抗人cLDL 多克隆抗体(2.5 μg/mL)在碳酸氢盐缓冲液(pH=9.6)中4 ℃包被过夜。次日采用0.1% Tween20清洗5次,然后用5%BSA/PBS非特异性结合缓冲液在室温下封闭2 h。每孔加入100 μL梯度稀释的标准品(美国Biomedical Technologies公司)或1∶10稀释后的血清样本,室温孵育2 h。洗涤5次后,每孔加入100 μL 稀释后的二级抗体(1∶1 000稀释),室温孵育1 h。洗涤5次后,每孔加入100 μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(美国Pierce公司)反应20 min,然后每孔加入50 μL H2SO4终止反应液(2 mmol/L)。根据标准品梯度浓度和在450 nm 处的吸光度A 值绘制标准曲线,并计算血清样本中cLDL水平。

1.2.2 其他血生化指标检测 收集临床资料、空腹静脉血和尿液标本。采用Beckman Coulter AU480生化分析仪和酶法测定血浆空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)。采用聚乙二醇修饰酶和α-环糊精直接法测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。采用Friedewald 方程计算LDL-C。采用免疫浊度抑制法测定全血糖化血红蛋白(HbA1c)水平。采用Jaffe 法测定血肌酐(SCr)。

1.2.3 颈动脉狭窄程度评估 DMCI组患者采集血样后24 h内完成颈动脉彩色多普勒超声检查,采用飞利浦E33彩色多普勒超声诊断仪检测CIMT。所有研究对象都由同一个医生检查。受检者躺下休息15 min后,将颈部完全暴露在外。在7.5 MHz频率下依次检测总颈动脉、颈内动脉和颈动脉分叉。颈动脉分叉前后1 cm 测量管腔内膜与中膜、外膜的垂直距离,计算CIMT 值。测量3次,得到平均值。根据CIMT值将患者分为正常组(0.5 mm≤CIMT<1.0 mm)、增厚 组(1.0 mm ≤CIMT<1.5 mm)、斑块组(CIMT≥1.5 mm)。另外根据颈动脉狭窄程度,分为无狭窄组(颈动脉内径无变化)、轻/中度狭窄组(颈动脉内径缩小程度<70%)、重度狭窄/完全闭塞组(颈动脉内径缩小程度≥70%)。

1.2.4 短期预后评价 DMCI组患者均完成90 d随访,根据改良Rankin 量表(mRS)评分,将DMCI患者分为预后良好组(mRS<3分,即完全无症状,或者有轻微症状但日常生活可自理)和预后不良组(mRS≥3分,即中重度残疾,日常生活部分需要/完全依赖别人的帮助)。

1.3 统计学处理 采用SPSS26.0软件包对数据进行分析。正态分布的计量资料采用表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;非正态分布的计量资料采用M(P25,P75)表示,组间比较采用Mann-WhitneyU检验或者Kruskal-Wallis检验。采用Pearson 或Spearman 法分析各指标相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清cLDL、sLOX-1水平对DMCI患者颈动脉狭窄或短期预后不良的诊断效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组临床资料比较 与对照组比较,DM 组和DMCI组FBG、hs-CRP、LDL-C 水平显著升高(P<0.05);此外,与DM 组比较,DMCI组患者糖尿病平均病程、FBG、hs-CRP、LDL-C、HbA1c水平亦显著升高,而HDL-C水平则显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。其余指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组研究对象临床资料的比较

2.2 3组血清cLDL、sLOX-1水平比较 与对照组比较,DMCI组血清cLDL、sLOX-1及DM 组sLOX-1水平显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。与DM 组比较,DMCI组血清cLDL、sLOX-1 水平显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组血清cLDL、sLOX-1水平比较[M(P25,P75)]

2.3 DMCI组患者血清cLDL、sLOX-1水平与糖尿病病程及其他生化指标的关系 Pearson相关分析显示,血清cLDL 水平与血清sLOX-1 水平呈正相关(r=0.605,P<0.001),血清cLDL、sLOX-1水平均与LDL-C 水平呈正相关(r=0.472、0.548,P<0.001)。见表3。

表3 DMCI患者血清cLDL、sLOX-1与各指标的相关性

2.4 DMCI组患者血清cLDL、sLOX-1水平与颈动脉狭窄程度、CIMT 值的关系 根据颈动脉狭窄程度,将DMCI患者分为无狭窄组(n=42)、轻中度狭窄组(n=50)、重度狭窄/完全闭塞组(n=12),3组间血清cLDL、sLOX-1 水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman 等级相关分析显示,血清cLDL、sLOX-1水平与颈动脉狭窄程度呈正相关(r=0.782、0.730,P<0.001)。根据CIMT 值将患者分为正常组(n=34)、增厚组(n=23)、斑块组(n=47),3组间血清cLDL、sLOX-1水平比较差异均有统计学意义(P<0.05);相关分析显示,血清cLDL、sLOX-1水平与CIMT 值呈正相关(r=0.850、0.669,P<0.001)。见表4、表5。

表4 不同颈动脉狭窄程度的DMCI患者血清cLDL、sLOX-1水平比较[M(P25,P75)]

表5 不同CIMT 值的DMCI患者血清cLDL、sLOX-1水平比较[M(P25,P75)]

2.5 DMCI组患者血清cLDL、sLOX-1水平与近期预后的关系 根据mRS评分,将DMCI患者分为预后良好组(n=52)与预后不良组(n=52),结果显示,预后不良组DMCI患者血清cLDL、sLOX-1水平显著高于预后良好组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 不同近期预后的DMCI患者血清cLDL、sLOX-1水平比较[M(P25,P75)]

2.6 血清cLDL、sLOX-1水平对DMCI患者颈动脉狭窄、短期预后的诊断效能 ROC 曲线分析结果显示,血清cLDL、sLOX-1预测DMCI患者颈动脉狭窄的曲线下面积(AUC)为0.901(95%CI:0.844～0.958)、0.861(95%CI:0.787～0.936);预测短期预后的AUC 为0.640(95%CI:0.534～0.746)、0.685(95%CI:0.583～0.787)。见表7。

表7 血清cLDL、sLOX-1水平对DMCI患者颈动脉狭窄和短期预后的诊断效能

3 讨论

糖尿病是以内环境代谢紊乱作为病理特征的疾病,是脑梗死的独立危险因素,研究显示,约1/5的脑梗死患者都患有糖尿病[8]。脑梗死的病理基础是动脉粥样硬化斑块的形成,导致管腔狭窄,然后是微血栓形成,最后是斑块脱落造成脑组织缺氧和缺血[9]。本研究结果显示,血清cLDL、sLOX-1水平与DMCI患者的颈动脉狭窄程度、斑块形成和短期预后密切相关。血清cLDL、sLOX-1水平随着颈动脉狭窄程度的增加以及CIMT 值的增加而增加,同时在DMCI预后不良的患者中血清cLDL、sLOX-1 水平显著上升。ROC曲线分析显示,血清cLDL、sLOX-1水平对于颈动脉狭窄和短期预后具有一定的诊断价值。

氨基甲酰化是一种翻译后修饰,在尿毒症、动脉粥样硬化等疾病中发生。LDL是氨基甲酰化的目标。cLDL具有增加炎症和致动脉粥样硬化的可能性。氨基甲酰化主要有两种途径,一种是尿素在水溶液中分解为氢酸(氢酸盐),另一种是通过髓过氧化物酶(MPO)催化成硫氢酸盐。人类所有的蛋白质在理论上都有发生氨基甲酰化的可能性,但其可能受到氨基的数量和可及性以及蛋白质的寿命等参数的影响。在人类动脉粥样硬化斑块中富含氨基甲酰化蛋白[10]。据报道,氨基甲酰化是慢性肾病患者发生心血管事件的关键因素之一,且在患有心血管疾病的慢性肾病患者中cLDL显著升高,在接受血液透析的糖尿病患者中,血清氨基甲酰化蛋白与不良心血管事件的发生密切相关[11]。cLDL 在人类内皮祖细胞中引起氧化应激和线粒体损伤,并产生活性氧,活性氧的产生降低了内皮源性NO的利用度,此外氰酸盐以时间和浓度依赖的方式抑制内皮一氧化氮合酶的表达。NO 生物利用度的降低是内皮功能受损的标志。有研究表明,cLDL诱导的自噬可能是动脉粥样硬化的潜在机制[12]。另一项基础研究表明,cLDL 单独通过 L6 大鼠肌肉细胞中胰岛素受体底物-1的 NO 介导的酪氨酸硝化减弱葡萄糖摄取,并表明 cLDL 可能参与2型糖尿病的发病机制[13]。与天然LDL 比较,cLDL 在循环系统中的清除率相对较低,巨噬细胞清道夫受体识别cLDL,从而促进胆固醇沉积以及巨噬细胞、泡沫细胞的形成,此外,cLDL促进单核细胞与内皮细胞的黏附和诱导内皮细胞的凋亡[14]。cLDL的增加会损害内皮功能,从而增加心血管风险。这也是在本研究中发现的发生脑梗死的患者血清cLDL 水平显著升高的原因。

LOX-1是主要存在于血管内皮细胞中的清道夫受体,其通过内皮摄取氧化低密度脂蛋白和电负性LDL诱导促动脉粥样硬化信号和斑块形成来促进内皮功能障碍,从而促进动脉粥样硬化斑块的形成、进展以及不稳定脱落等过程,最终发生心血管不良事件[15]。研究发现,LOX-1 在破裂夹层内膜外的肥厚性介质中显著表达,在急性脑出血或者脑卒中患者中循环sLOX-1的水平显著增加[16]。提示血清sLOX-1水平与心脑血管疾病的进展有关。SPEER 等[17]证实cLDL通过LOX-1激活导致p38-MAPK 和NADPH-氧化酶激活、eNOS解偶联、内皮ROS生成增加、NO生物利用度降低以及最终内皮依赖性血管舒张功能受损而诱导内皮功能障碍。HOLY 等[18]在小鼠模型中证实cLDL通过激活LOX-1受体在血管细胞和血小板中诱导血栓前效应,并增强体内血栓形成。而血栓和动脉粥样硬化是血管疾病发生的重要原因。本研究结果也显示,在DMCI患者血清中cLDL、sLOX-1水平显著增加,同时随着颈动脉狭窄程度以及CIMT 值的增加而增加(P<0.05)。提示血清cLDL、sLOX-1水平与DMCI患者颈动脉粥样硬化密切相关。此外,血清cLDL、sLOX-1水平还与LDL-C水平呈正相关(P<0.05)。已有研究显示,LDL-C 水平增加与动脉粥样硬化性脑梗死患者的预后密切相关[19]。这可能是本研究中部分患者发生预后不良的原因。STANKOVA 等[20]也证明cLDL 和 sLOX-1 可作为诊断糖尿病并发症的标志物。这与本研究结果一致,血清cLDL、sLOX-1具有预测DMCI患者短期预后的价值。

综上所述,血清cLDL、sLOX-1水平升高与DMCI患者颈动脉狭窄和短期预后不良显著相关,检测血清cLDL、sLOX-1水平有望成为评价DMCI患者颈动脉狭窄程度和短期预后的生物标志物。