袁建玲， 邵钟铭， 邹园， 伍彩霞， 郑阿秀， 邢敬慈，白建荣， 揭伟，2△， 申志华△

血清反应因子N端片段对鼻咽癌细胞增殖及迁移能力的影响*

袁建玲1，3， 邵钟铭1， 邹园1， 伍彩霞1， 郑阿秀1， 邢敬慈1，白建荣1， 揭伟1，2△， 申志华1△

（1广东医科大学基础医学院病理生理学教研室，广东 湛江 524023；2海南医学院急救与创伤研究教育部重点实验室，海南 海口 571199；3北京大学深圳医院病理科，广东 深圳 518036）

探讨血清反应因子N端剪切片段（SRF-N）对鼻咽癌（NPC）细胞增殖和迁移能力的影响与机制。应用SRF全长（SRF-Full，1～508 aa）、SRF-N（1～254 aa）及阴性对照（NC）慢病毒颗粒感染人NPC细胞系6-10B，经嘌呤霉素抗性筛选结合Western blot检测Flag标签化融合蛋白的表达获得单克隆细胞株，CCK-8实验分析细胞活力的改变，划痕损伤修复实验和Transwell实验分析细胞迁移能力，细胞-基质黏附实验分析细胞黏附能力，Western blot检测细胞增殖相关蛋白增殖细胞核抗原（PCNA）和上皮-间充质转化（EMT）相关指标的表达，双萤光素酶报告基因实验检测SRF-Full和SRF-N对启动子的调节效应。成功用SRF-Full、SRF-N及NC慢病毒感染6-10B细胞，经嘌呤霉素抗性筛选结合Flag标签蛋白的表达获得相应的单克隆细胞株，分别标记为6-10BSRF-Full、6-10BSRF-N和6-10BNC。与6-10BNC细胞相比，6-10BSRF-Full细胞活力、迁移能力和与基质的黏附能力均显著增强（<0.01），而6-10BSRF-N细胞较6-10BSRF-Full细胞活力、迁移能力及黏附能力均显著下降（<0.01）。6-10BSRF-Full细胞中波形蛋白（vimentin）、神经钙黏素（N-cadherin）和Snail1的表达水平较6-10BNC细胞显著升高（<0.01），上皮钙黏素（E-cadherin）表达水平显著下降（<0.01）；而6-10BSRF-N细胞中vimentin、N-cadherin和Snail1的表达水平较6-10BSRF-Full细胞显著下降（<0.05），E-cadherin表达水平显著上升（<0.05）。双萤光素酶活性实验结果表明，与NC相比，SRF-Full显著激活启动子（<0.001）；与SRF-Full相比，SRF-N显著抑制启动子活性（<0.01）。SRF-Full促进而SRF-N抑制NPC细胞的增殖和迁移；SRF-N抑制启动子活性而介导NPC的EMT；SRF-N具有潜在的抗NPC作用。

鼻咽癌；血清反应因子N端片段；细胞增殖；细胞迁移；上皮-间充质转化

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是起源于鼻咽黏膜的上皮性恶性肿瘤，远处转移和局部复发是影响患者预后的关键因素。目前对NPC侵袭转移的机制仍不甚清楚。课题组前期已经报道了部分基因的表达异常与NPC的增殖转移相关，丰富了NPC发病学理论［1-3］。新近，有关单细胞测序技术在NPC上的应用，更为阐明基因、环境因素在NPC的发病机制提供了新思路［4-5］。尽管如此，进一步发现和鉴定介导NPC细胞侵袭转移的关键因素，仍然是NPC防治研究的重要内容。

血清反应因子（serum response factor， SRF）属于MADS（Mcm1， Agamous， Deficiens and SRF）转录因子家族成员，进化保守，在生物体内普遍存在。通过与辅因子相互作用并结合CArG序列元件［CC（A/T）6GG］，SRF调控了超过200个下游靶基因的转录表达，涉及细胞的生长、迁移、骨架形成等方面，其表达和活性的异常与包括肿瘤在内的很多人类疾病关系密切［6-9］。SRF过表达促进某些肿瘤的临床进展，提示SRF可能是潜在的肿瘤预后判断和治疗靶标［8-10］。

2003年Chang等［11］报道在心力衰竭的心脏组织中全长SRF（SRF-Full， 1～508 aa）可被caspase-3剪切成N端片段（SRF-N， 1～254 aa）及C端片段（SRF-C， 255～508 aa）。由于SRF-N含有完整MADS结合域但不含有催化结构域，因此可与SRF-Full竞争性结合靶基因的CArG盒，从而抑制下游基因的转录激活。本研究假设SRF-N具有一定的抗肿瘤特性，以NPC细胞系6-10B为对象，体外研究过表达SRF-N对NPC细胞增殖、迁移、黏附、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）等特性的影响，为基于SRF-N靶点的抗NPC研究提供参考资料。

材料和方法

1　细胞系

NPC细胞系6-10B为南方医科大学病理学系惠赠，我室常规培养传代后液氮冻存。293T细胞购自中国科学院上海细胞库。

2　主要试剂及仪器

基于pEZX-PG04.1构建的启动子、阴性对照（negative contorl， NC）及突变型（mutant， Mut）启动子过表达质粒，萤光素酶表达质粒，SRF-Full和SRF-N过表达质粒（上海吉凯基因化学技术有限公司）；Matrigel（Corning）；鼠抗人Flag单克隆抗体（Sigma）；兔抗人E-cadherin和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）单克隆抗体（CST）；鼠抗人N-cadherin、vimentin和β-actin单克隆抗体，兔抗人Snail1单克隆抗体，HRP或FITC标记的II抗（武汉三鹰技术有限公司）；X-tremeGENE™ HP DNA转染试剂和定量PCR试剂盒（Roche）；Dual-Luciferase®Reporter Assay System （Promega）；RNA抽提试剂盒、RT试剂盒和Lipofectamine 3000（Invitrogen）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）、RPMI-1640培养液和DMEM培养液（HyClone）；蛋白酶抑制剂、RIPA蛋白裂解液和BCA试剂盒（江苏碧云天生物技术有限公司）。ECL发光剂、PVDF膜、细胞培养箱、全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；定量PCR仪（Roche）；荧光显微镜（Olympus）；凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）；蛋白电泳仪（Bio-Rad）。

3　方法

3.1细胞培养用新配制的RPMI-1640完全培养液（含10% FBS、1×105U/L青霉素和0.1 mg/L链霉素）重悬复苏后离心沉淀的6-10B细胞，经吹打混匀后接种于培养皿，并置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度培养箱内培养，每2～3 d更换培养液，倒置显微镜下观察细胞形态。待贴壁细胞完全生长汇合后，用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化传代，待细胞扩增至一定数量后，收获细胞进行相关实验。293T细胞用含10% FBS的DMEM培养液重悬，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度培养箱内培养，每2～3 d更换培养液。

3.2慢病毒感染SRF-N过表达、SRF-Full过表达及NC过表达慢病毒颗粒参考既往方法获得［12］。6-10B细胞常规培养，0.25%胰酶消化后完全培养液重悬，以每孔4×104个细胞接种于6孔板中，分为3组，标记为阴性对照病毒（6-10BNC）组、SRF-N过表达慢病毒（6-10BSRF-N）组及SRF-Full过表达慢病毒（6-10BSRF-Full）组。当细胞融合度达到60%～70%时，进行病毒感染。以感染复数100 感染6-10B细胞，计算SRF-Full、SRF-N及NC病毒的体积，0.5 mL polybrene病毒工作液稀释各组病毒；将稀释好的病毒液加入6孔板内进行感染，12 h 内弃去病毒液，更换2 mL新鲜的完全培养液；24 h后换液；48 h后添加嘌呤霉素（2.0 mg/L）筛选；72 h后换液，在荧光显微镜下观察GFP信号来判断感染效果，培养细胞以备后续实验。

3.3单克隆细胞株筛选6-10BSRF-Full、6-10BSRF-N和6-10BNC混合克隆细胞经过2.0 mg/L嘌呤霉素抗性筛选3 d后，以0.5 mg/L的浓度维持培养。采用有限稀释法，将这3种细胞分别用0.25%胰酶消化并转移至96孔板，调整浓度为每孔1个细胞，待生长出单克隆细胞团后，荧光显微镜下观察绿色荧光情况，并在孔板背面相应位置做好标记。将转染阳性的单克隆细胞株经消化传代扩大培养，并通过Western blot检测含Flag标签化的融合蛋白的表达水平。

3.4CCK-8法检测细胞活力将上述3组细胞按每孔2×103个共100 μL接种于96孔板， 每组6个复孔，边缘孔用无菌PBS填充，过夜孵育。贴壁后，分别在培养时点0、24、48及72 h向每孔细胞加入10 μL CCK-8试剂，轻轻敲击培养板混匀液体，37 ℃继续孵育4 h，使用酶标仪测定450 nm吸光度（）值。

3.5Western blot提取各组细胞总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，取50 μg蛋白用于凝胶电泳。蛋白转移至PVDF膜，经脱脂奶粉封闭后加入Ⅰ抗（Flag， 1∶3 000； PCNA， 1∶1 000； N-cadherin， 1∶500； E-cadherin， 1∶500； vimentin， 1：500； Snail1， 1∶1 000； β-actin， 1∶2 000）4 ℃过夜孵育，TBST洗涤，HRP标记的IgG Ⅱ抗（1∶3 000）室温孵育2 h，ECL发光后凝胶成像系统扫描获得目的蛋白条带。

3.6细胞基质黏附实验配制Matrigel，每孔2 μg铺于96孔板内。挑选对数生长期状态良好的上述3种细胞，消化计数，调整细胞浓度，以每孔4×104接种在铺胶的96孔板中，每组4个复孔；置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养2和4 h；弃上清，PBS冲洗3次；每孔加入100 μL含10% FBS的RPMI-1640培养液和10 μL CCK-8液，继续培养4 h；酶联免疫检测仪上450 nm处测定各孔的值（代表黏附细胞数）。

3.7Transwell迁移实验Transwell小室置于24孔板。上述3种培养细胞消化后用含0.5% FBS的DMEM培养液重悬，取2×104个细胞接种于Transwell小室的上室，体积为200 μL。Transwell小室的下室中加含10% FBS的DMEM培养液500 μL，置于37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养24 h，培养结束后取出小室并用4%中性甲醛固定15 min，0.1%结晶紫液染色5 min，用棉签小心擦除小室上室面细胞，PBS洗涤后在20×显微镜物镜下观察并拍照。以穿膜的细胞数差异代表细胞运动能力的改变。每张膜选2个典型视野，每组重复3孔。

3.8划痕损伤修复实验参考既往方法进行操作［2］。简言之，将上述3种细胞接种6孔板培养至单层汇合状态，用200 μL吸头尖每孔划3条平行线，PBS洗去未贴壁细胞，加入含0.5% FBS的RPMI-1640培养液，于培养时点0、24和48 h镜下观察并拍照，ImageJ 8.0软件分析伤口愈合程度。

3.9双萤光素酶报告基因实验293T细胞接种24孔板，按照X-tremeGENE™ HP转染试剂使用说明书将表达质粒转染至目的细胞。实验分组：Promoter-NC+SRF-Full组（SRF-Full过表达质粒组）、Promoter-NC+SRF-N组（SRF-N过表达质粒组）、Promoter-Snail1+SRF-Full组（启动子和SRF-Full过表达质粒组）、Promoter-Snail1+SRF-N组（启动子和SRF-N过表达质粒组）、Promoter-Mut+SRF-Full（启动子突变体和SRF-Full过表达质粒组）和Promoter-Mut+SRF-N组（启动子突变体和SRF-N过表达质粒组）。每孔启动子质粒、SRF表达质粒和萤光素酶表达质粒按0.5 μg∶0.5 μg∶0.02 μg转染，每组3个复孔，按照说明书操作检测萤光素酶活性。根据软件预测，人基因启动子存在4个潜在的SRF结合位点，分别位于转录起始位点上游118～101 nt （#1， 5'-CTTCACTAAACGAGGCTG-3'）、786～775 nt （#2， 5'-GCCCAAGTGAGG-3'）、1 395～1 378 nt （#3， 5'-AAACACTGGATAAGGGAA-3'）和1 935～1 924 nt （#4， 5'-GGCCTTATCTGC-3'）处。本研究使用的突变体启动子序列将上述#1和#3位点同时突变为5'-GGGCTCTATGGGGGGTTT-3'， #2和#4位点同时突变为5'-CTATGGGGGGTT-3'。

4　统计学处理

使用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。计量资料数据采用均数±标准差（Mean±SD）表示。组间比较采用单因素方差分析或非配对检验。以<0.05为差异有统计学意义。

结果

1　成功筛选SRF-Full及SRF-N过表达单克隆6-10B细胞

按照感染复数为100加入SRF-Full、SRF-N过表达和NC慢病毒，72 h后荧光显微镜下观察到6-10B细胞中有较强的胞核绿色荧光信号，经嘌呤霉素筛选后感染效率达95%以上（图1A），通过Western blot成功在预测分子量大小的位置检测到SRF-Full-Flag及SRF-N-Flag融合蛋白（图1B）。采用有限稀释法， 将转染阳性细胞接种至96孔板进行单克隆细胞筛选，最终挑选出4个NC，2个SRF-N和4个SRF-Full过表达单克隆细胞。Western blot结果显示，10个单克隆细胞株的融合蛋白SRF-Full-Flag及SRF-N-Flag的表达水平不等（图2）。结合细胞形态改变的情况，最终挑选第1号（#1）6-10BNC、第1号（#1）6-10BSRF-N及第3号（#3）6-10BSRF-Full单克隆作为后续实验对象。

Figure 1.Observation of lentivirus-infected 6-10B cells and identification of the expression of Flag-tagged fusion protein. A： the GFP fluorescence 72 h after infection of 6-10B cells with lentivirus （scale bars=200 μm）； B： the expression of Flag-tagged fusion protein in virus-infected 6-10B cells.

Figure 2.The expression of Flag-tagged fusion protein in monoclonal cell lines.

2　SRF-Full和SRF-N过表达后细胞增殖能力的变化

CCK-8实验结果显示，随着时间推移，6-10BSRF-Full的活力较同一时点的6-10BNC细胞增加（<0.01），而6-10BSRF-N的活力较6-10BSRF-Full却降低（<0.01），见图3A。通过Western blot检测细胞增殖相关蛋白PCNA的表达，提示6-10BNC及6-10BSRF-N细胞PCNA的表达情况差异不显著，6-10BSRF-Full细胞中PCNA表达水平较二者均显著增加（<0.01），见图3B。

Figure 3.The effects of overexpression of SRF-Full and SRF-N on the proliferation of 6-10B cells. A： cell viability detected by CCK-8 assay； B： Western blot detection of PCNA protein level in virus-infected 6-10B cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs 0 day； ##P<0.01 vs SRF-Fullgroup.

3　SRF-Full和SRF-N过表达后细胞迁移能力的变化

划痕损伤修复实验结果表明，与6-10BNC细胞相比，48 h后6-10BSRF-Full细胞划痕伤口的面积显著减小（<0.01），而6-10BSRF-N细胞伤口的面积较6-10BSRF-Full显著增大（<0.01），见图4A。进一步采用Transwell实验分析SRF-Full和SRF-N过表达后对6-10B细胞迁移能力的影响，结果显示，6-10BSRF-Full细胞穿膜细胞数比6-10BNC细胞显著增多（<0.01），而6-10BSRF-N细胞穿膜细胞数较6-10BSRF-Full细胞显著减少（<0.01），见图4B。

Figure 4.Impacts of overexpression of SRF-Full and SRF-N on the migration of 6-10B cells. A： representative images of wound healing assay （scale bar=200 μm） and the quantitative results； B： representative images of Transwell migration assay （scale bar=50 μm） and the quantitative results. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs NC group； ##P<0.01 vs SRF-N group； △△P<0.01 vs 24 h.

4　SRF-Full和SRF-N过表达后细胞黏附能力的变化

将与Matrigel黏附的细胞用CCK-8液孵育后，酶标仪测定其吸光度值，结果显示6-10BSRF-Full细胞平均吸光度为3.41±0.12，与6-10BNC细胞的平均吸光度（1.47±0.01）相比显著升高（<0.01）。6-10BSRF-N细胞的平均吸光度为1.50±0.01，较6-10BSRF-Full细胞显著降低（<0.01），见图5。

Figure 5.Impacts of overexpression of SRF-Full and SRF-N on the adhesion of 6-10B cell to matrix. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs NC group； ##P<0.01 vs SRF-N group.

5　过表达SRF-Full和SRF-N后EMT相关蛋白表达的改变

Western blot检测结果显示，与6-10BNC相比，6-10BSRF-Full细胞的间充质细胞标志物（N-cadherin和vimentin）和转录因子Snail1显著增加（均<0.01），而上皮细胞标志物E-cadherin显著减少（<0.01）；与6-10BSRF-Full相比，6-10BSRF-N细胞的间充质细胞标志物（N-cadherin和vimentin）和转录因子Snail1显著减少（<0.05），上皮标志物E-cadherin表达量显著增加（<0.05），见图6。

Figure 6.Western blot analysis of EMT-related proteins in 6-10B cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group； #P<0.05， ##P<0.01 vs SRF-N group.

6　SRF-Full和SRF-N对Snail1启动子活性的影响

通过构建SRF-Full、SRF-N、NC启动子、启动子及启动子突变体质粒，按照既定分组将质粒共转染到293T细胞中，分别收集各组细胞培养48 h后的培养液上清进行萤光素酶活性检测。结果显示，与Promoter-NC+SRF-Full相比，Promoter-Snail1+SRF-Full组启动子活性显著增强（<0.01），且Promoter-Snail1+SRF-Full组较Promoter-Snail1+SRF-N组具有更高的启动子活性（<0.01）；与Promoter-Snail1+SRF-Full组相比，Promoter-Snail1-Mut+SRF-Full组启动子其活性显著下降（<0.01）；Promoter-Snail1-Mut+SRF-Full组与Promoter-Snail1-Mut+SRF-N组启动子活性无显著差异，见图7。

Figure 7.The effects of SRF-Full and SRF-N on the activity of Snail1 promoter assessed by dual-luciferase reporter assay. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Promoter-NC+SRF-Full group； ##P<0.01 vs Promoter-NC+SRF-N group； △△P<0.01 vs Promoter-Snail1+SRF-Full group.

讨论

SRF表达异常与人类某些疾病的病理生理过程关系密切，如肿瘤、纤维化、神经损伤再生及心功能衰竭等［13］。有报道称SRF在人类多种肿瘤中高表达，目前已经观察到SRF高表达可促进人类胃癌［9］、肝癌［14］、甲状腺癌［15］和宫颈癌［16］等多种恶性肿瘤的进展。因此，靶向SRF对肿瘤的分子治疗具有潜在的临床意义。有报道显示CCG-100602可以抑制TGF-β1诱导的SRF的表达［17］，但该抑制剂的特异性不强，因而挖掘内源性SRF抑制分子具有重要的意义。针对前述的SRF-Full可被剪切产生SRF-N分子的事实，结合SRF-N的结构特点［11］，促使我们思考SRF-N是否具有抗肿瘤特性。本研究即应用NPC细胞模型来进行验证。

我们首先委托上海赛业生物技术有限公司基于慢病毒载体pEZ-Lv201分别构建了SRF-Full、SRF-N和NC的过表达质粒，包装了相应的慢病毒颗粒并经过相应质检，提示慢病毒包装成功并具有较高滴度（未发表资料）。将相应慢病毒分别感染6-10B细胞，荧光显微镜下观察到GFP信号。由于当前针对SRF-N的商品化抗体同时也可以和SRF-Full结合，抗体的检测结果特异性不强，因而我们采用检测Flag与目的蛋白的融合蛋白方式来进行外源性蛋白表达的验证。结果显示，从慢病毒感染的细胞中分别检测到分子量分别约70 kD和接近40 kD的Flag融合蛋白条带。这些阳性条带大小与预期的SRF-Full-Flag和SRF-N-Flag的分子量大小一致，提示目的基因成功表达和慢病毒成功感染。继而采用经典的单克隆细胞挑选法获得相应单克隆细胞株，这些表型相对均一的单克隆细胞为后续研究奠定了扎实的基础。

在获得合格的细胞模型后，我们从体外实验角度分析SRF-N对NPC细胞增殖、迁移、黏附及EMT的影响。结果表明，与6-10BNC细胞相比，6-10BSRF-Full的增殖能力增加，而6-10BSRF-N细胞的增殖活力较6-10BSRF-Full减弱，提示过表达SRF-Full可促进NPC细胞增殖，而过表达SRF-N片段在一定程度上抑制了细胞增殖，这一结果与Western blot检测到的PCNA蛋白的趋势是一致的。此外，本实验结果也证实，过表达SRF-Full可以促进6-10B细胞的迁移和基质黏附能力，而SRF-N具有一定的抑制6-10B细胞迁移和基质黏附的能力，进一步提示了SRF-N具有拮抗NPC进展的生物学特性。

越来越多的证据表明SRF过表达可能影响肿瘤细胞EMT过程［18-21］。EMT即上皮源性肿瘤细胞获得间充质源性细胞表型，通常表现为上皮细胞标志物如E-cadherin和ZO-1表达下降，而间充质细胞标志物如vimentin和N-cadherin等表达上升，同时功能上发生EMT的肿瘤细胞侵袭、运动能力增加。本研究通过Western blot检测EMT相关蛋白表达的变化，观察到过表达SRF-Full能有效诱导6-10B细胞N-cadherin、vimentin和Snail1表达增加，同时E-cadherin表达减弱，过表达SRF-N则出现与SRF-Full相反的趋势。由此提示，SRF-Full能促进NPC细胞EMT进展，而SRF-N能部分阻断EMT进程。这一结果也与功能上细胞划痕损伤修复、迁移与基质粘附的结果趋势相一致。由此可见，NPC中SRF-Full过表达可以通过EMT机制来促进肿瘤细胞的侵袭和转移，而SRF-N过表达后显示出一定程度的负性调控EMT的作用而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

EMT被认为是由相关转录因子信号触发的，这些转录因子主要包括Snail1、Slug、ZEB1、ZEB2和Twist1等，它们的激活被认为是使细胞获得侵袭性的关键过程［22-23］。既往报道，Snail1是最早被认为可通过与E-box基序结合直接抑制E-cadherin转录来驱动EMT的转录因子之一［24］。研究表明，SRF从胞质移位入核以上调Snail1的表达，Snail1和SRF的亚细胞定位影响细胞的表型和功能［25］，因此，SRF/Snail1信号的活化促进细胞发生EMT［26］。本实验也显示SRF过表达显著增加6-10B细胞中Snail1的表达。为探究NPC中SRF与Snail1之间的调控关系，我们通过启动子活性分析实验证明，SRF-Full增强了Snail1启动子活性，而SRF-N在一定程度上抑制Snail1的转录活性，这与预期结果相一致。由此可见，SRF-N通过直接抑制Snail1的转录活性来实现减弱EMT的作用。需要注意的是，本启动子活性实验中，细胞在培养过程中产生的内源性SRF也可能发挥了一定作用。此外，Snail1突变型启动子与SRF-Full和SRF-N较之NC对照启动子仍具有较高的活性，很可能与SRF与Snail1结合位点未完全突变有关，

总之，本研究结果提示SRF-Full过表达促进NPC细胞的增殖和迁移能力，而SRF-N过表达在一定程度上抑制了NPC细胞的增殖、迁移和黏附能力。机制上，SRF-N通过抑制Snail1启动子的转录活性来实现调控NPC细胞的EMT，SRF-N是SRF-Full的内源性拮抗因子。进一步明确SRF-N在抗肿瘤治疗中的作用具有重要意义和潜在的临床转化价值。本研究为体外细胞学实验，后期需要从动物实验及临床队列研究的角度进一步验证。

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Effects of N-terminal fragment of serum response factor on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells

YUAN Jian-ling1，3， SHAO Zhong-ming1， ZOU Yuan1， WU Cai-xia1， ZHENG A-xiu1， XING Jing-ci1， BAI Jian-rong1， JIE Wei1，2△， SHEN Zhi-hua1△

（1，，，524023，；2，，，571199，；3，，518036，）

To explore the effects of the N-terminal fragment of serum response factor （SRF-N） on the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma （NPC） cells and its mechanisms.The full-length SRF （SRF-Full， 1 to 508 aa） overexpression， SRF-N （1 to 254 aa） overexpression and negative control （NC） lentiviral particles were used to infect human NPC 6-10B cells， and the monoclonal cells were obtained by puromycin resistance screening. Western blot was applied to detect the expression of Flag-tagged fusion protein. The cell viability， migration and adhesion were analyzed by CCK-8 assay， wound healing assay， Transwell assay and matrix-adhesion assay. The changes in proliferation-associated protein proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and epithelial-mesenchymal transition （EMT）-related factors were assessed by Western blot. Finally， dual-luciferase reporter assay was used to detect the regulatory effects of SRF-Full and SRF-N onpromoter.The 6-10B cells were successfully infected with SRF-Full， SRF-N and NC lentiviruses. The corresponding monoclonal cell lines， which were obtained by puromycin resistance screening combined with the expression of Flag tag protein， were labeled as 6-10BSRF-Full， 6-10BSRF-Nand 6-10BNC， respectively. Compared with 6-10BNCcells， increased viability， migration and adhesion to the matrix were observed in 6-10BSRF-Fullcells （<0.01）， while these capabilities of 6-10BSRF-Ncells were decreased compared with 6-10BSRF-Fullcells （<0.01）. Compared with 6-10BNCcells， the expression of vimentin， N-cadherin and Snail1 in 6-10BSRF-Fullcells were significantly increased （<0.01）， while the expression of E-cadherin was significantly decreased （<0.01）. Compared with 6-10BSRF-Fullcells， the expression of vimentin， N-cadherin and Snail1 in 6-10BSRF-Ncells was significantly decreased （<0.05）， while the expression of E-cadherin was significantly increased （<0.05）. The results of dual-luciferase reporter assay showed that SRF-Full significantly activatedpromoter compared with NC （<0.01）， while SRF-N significantly inhibitedpromoter compared with SRF-Full （<0.01）.SRF-Full promotes but SRF-N inhibits the proliferation and migration of NPC cells. SRF-N inhibitspromoter activity and mediates EMT of NPC. SRF-N may serve as a potential anti-NPC target.

Nasopharyngeal carcinoma； N-terminal fragment of serum response factor； Cell proliferation； Cell migration； Epithelial-mesenchymal transition

R 363.2； R739.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.019

1000-4718（2022）03-0535-08

2021-10-11

2022-01-13

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（No. 81402415）；广东省扬帆计划高层次人才项目（No. 4YF16007G）

申志华 Tel： 0759-2388587； E-mail： szh75@126.com； 揭伟 Tel： 0898-66968217； E-mail： wei_jie@hainmc.edu.cn

▲共同第一作者:并列第1作者

（责任编辑：林白霜，罗森）