罗晓恒，赵哲坤,2，高宜，赵爽*

（1.北京市农林科学院农产品加工与食品营养研究所，北京市农林科学院植物保护研究所，北京 100097）（2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038）（3.北京市西城区妇幼保健中心，北京 100053）

榆黄菇（Pleurotus citrinipileatus）又名金顶侧耳、黄金菇、榆黄蘑，隶属于担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales），侧耳科（Pleurotaceae），侧耳属（Pleurotus），是较为珍贵的经济食用菌之一。野生榆黄菇子实体因呈浅黄色或黄色且腐生于榆木上而得名，主要分布于欧洲、美洲、中国、东南亚等地[1]，榆黄菇香味十分浓郁，形状为浅漏斗形，菌肉为白色，肉质脆嫩；柄为偏生，菇体成簇生长[2]。榆黄菇是一种北方地区常见的食用菌，其因为外型喜人又是食药兼用的食用菌，现在各地都有栽培，例如：在河南焦作泌阳县扩大了榆黄菇的种植规模，增加了经济效益，帮助了很多村民脱贫致富，巩固了脱贫攻坚的成果[3]。有些地方甚至将榆黄菇种植业与茶园业、林园等相结合科学的发展，进一步开发创新榆黄菇种植与农村休闲资源结合的旅游模式，综合提升茶园和林园的利用率和经营效益[4]。

随着人们对生活质量要求的提高，榆黄菇因其具高蛋白、低脂肪、低糖等特点，已经成为了人们餐桌上常见的美味佳肴。榆黄菇富含蛋白质、氨基酸、维生素、多糖、钠、钙、铁、钾、锌[5,6]等营养物质，食用榆黄菇不但可以帮助人体补充所需的营养物质和增强人体免疫力，而且长期食用可以发挥降低血压、抗癌、抗脂肪肝、延缓衰老、降低血糖血脂和抗病毒[7,8]等功效。但是有关榆黄菇功能多糖的提取纯化研究比较少，对于榆黄菇抗炎多糖的相关报道较为少见。其功能研究多集中在护肝消脂[9]、抗氧化和保湿等方面[10]。石堃等[11]对榆黄菇多糖进行体外抗氧化活性的测定，结果显示榆黄菇多糖具有一定的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力以及还原力。王晓洁等[12]利用MTT比色法发现榆黄菇菌丝体胞外多糖对小鼠-S180癌细胞以及人结肠低分化腺癌细胞均具有抑制作用。同时榆黄菇多糖可以通过调节免疫细胞来提高身体抵抗病毒和抵御细菌入侵感染的能力，能够明显地增强体液免疫系统和细胞免疫功能的作用[13,14]。本试验通过体外建立炎症细胞模型，综合评价榆黄菇多糖的抗炎作用，旨在为研制抗炎功能性食品或天然药物的开发提供原料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

RAW264.7细胞，北纳创联生物技术有限公司；榆黄菇菌株，北京市农林科学院植保所保藏菌株。

1.2 仪器与试剂

Steti-cycle371 CO2培养箱，美国Thermo公司；R-215旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；电子天平，美国奥豪斯公司；真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；电热恒温水浴锅，北京长安永剑科学仪器有限公司；SHZ-88A恒温水浴锅，北京精科华瑞仪器有限公司；5810R冷冻离心机，美国Eppendrof公司；IX-71倒置显微镜，日本 Olympus公司；移液器，美国Drummond公司；荧光全波长酶标仪，Tecan Austria GmbH公司。

胎牛血清（FBS）、RPMI高糖培养液、胰酶和双抗（青霉素和链霉素），美国 Invitrogen公司；MTT测试液、二甲基亚砜（DMSO），美国Amresco公司；台盼蓝染液和无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；BCA测定试剂盒，北京博迈德基因技术有限公司；NOS测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)测定试剂盒，北京四正柏生物科技有限公司；水为超纯水；化学试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 榆黄菇多糖的提取及纯化

榆黄菇菌株接种到综合 PDA试管中进行活化，25 ℃恒温培养；待菌丝长满试管后将其接种到二级培养基中（棉籽壳80%、麸皮18%、石膏1%、糖1%、料水比为 1:1），25 ℃恒温培养室培养至菌丝长满；将二级种接种到栽培袋中（棉籽壳78%、麸皮20%、膏1%、糖1%、料水比为1:1），25 ℃的条件下进行发菌，菌种长满栽培袋后进行搔菌并移入温室大棚；出菇条件保持湿度在90%以上，温度约为20～25 ℃，收集第一潮榆黄菇子实体，冷冻干燥后放入破碎机，制成质地均一的榆黄菇干粉。定量称取榆黄菇干粉，按1:30的比例加入去离子水，在90 ℃高温水浴锅中水浴4 h，水浴后混合物在高速冷冻离心机中以6000 r/min离心30 min。取上清液，旋蒸浓缩，量取上清液体积，按照1:4的比例加入无水乙醇搅拌均匀后盖上锡箔纸，置于4 ℃冰箱中冷藏过夜使多糖析出，然后以6000 r/min、离心30 min得到榆黄菇固体粗多糖，放入于 60 ℃的烘箱中烘干至溶剂挥发，再配置成多糖溶液待用[15]。

利用Sevage法去除多糖溶液中的蛋白质，重复多次直至无蛋白质凝胶层析出。收集好每次除蛋白后的上清液，混合上清液后加入无水乙醇得到沉淀的多糖，烘干去除溶剂再用去离子水溶解，得到去除蛋白的榆黄菇粗多糖溶液[16]。

利用 10 mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲溶液（PBBuffer，PBS）平衡DEAE-Cellulose层析柱（5×20 cm），榆黄菇粗多糖溶液调节pH值上样，用0、0.2 mol/L NaCl和1 mol/L NaCl进行梯度洗脱，洗脱流速为1.5 mL/min，分别收集不同时间段洗脱出的溶液，测定洗脱液的多糖浓度，收集到两个多糖含量较高的洗脱峰D1和D2。将组分D1和D2分别上样于Superdex-75分子凝胶层析柱，用超纯水进行洗脱，洗脱流速为0.5 mL/min，测定洗脱液的多糖浓度，收集多糖洗脱峰PSI和PSII，冷冻干燥48 h后获得多糖纯品。

1.3.2 细胞的培养

将巨噬细胞 RAW264.7培养于含有 10%胎牛血清、1% 10 mg/L链霉素（原液浓度）和10000 U/mL青霉素的RPMI高糖培养基中，放置于37 ℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养，每隔一天用PBS清洗后再用0.02% EDTA和0.25%的胰蛋白酶细胞消化液进行传代培养。

1.3.3 利用LPS诱导巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型

取对数生长期细胞按照1×104cells/孔的数目接种到96孔板中，放置于培养箱中培养6 h后用PBS清洗，分别设置空白组和炎症模型组，炎症组加入不同浓度的LPS溶液，每个组分别设置3个复孔，每个孔终浓度分别为1、3、5、7、9 μg/mL，空白组则加入等体积的细胞培养液，培养24 h后收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，测定TNF-α浓度水平。因为TNF-α是细胞达到炎症状态最初产生的细胞因子，所以我们选择TNF-α的分泌水平最高的一组来作为脂多糖的最佳诱发炎症的浓度。

1.3.4 榆黄菇多糖纯品对RAW264.7炎症细胞活力的影响

取对数生长期细胞按照8×103cells/孔的数目接种到96孔板中，放置于培养箱中培养6 h后用PBS清洗，分别设置空白组、炎症组和给药组，除空白组外加入终浓度为5 μg/mL的LPS溶液诱导细胞形成炎症，将不同作用浓度的榆黄菇多糖加入培养板中，使PSI和PSII终浓度为125、250、500、1000、2000 μg/mL，不加多糖的处理作为空白组，每组设置3个重复孔，炎症组、空白组加入同等体积的细胞培养液，放置于培养箱培养24 h，采用MTT法测定细胞存活率，以筛选到促增殖效果最强的作用浓度为目标，调整PSII作用浓度，使其终浓度为12.5、25、50、100、200、250 μg/mL，选择刺激细胞增殖的最高浓度作为抗炎功能研究的给药剂量。

1.3.5 中性红试验观察细胞吞噬活性

取对数生长期细胞按照1×104cells/孔的数目接种到96孔板中，放置于培养箱中培养24 h，用PBS清洗后，分别设置空白组、炎症组和给药组，除空白组外加入终浓度为5 μg/mL的LPS溶液诱导细胞形成炎症，过2 h后给药组加入用细胞培养液稀释的多糖PSI和PSII浓度分别为500 μg/mL和200 μg/mL的溶液200 μL，每组设置3个重复孔，炎症组、空白组加入同等体积的细胞培养液，置于培养箱中培养24 h后弃去培养液，用PBS清洗，加入0.09%中性红溶液200 μL置于培养箱中培养4 h，吸弃中性红培养液，用PBS清洗，加入200 μL细胞裂解液（体积比为1:1=冰醋酸:无水乙醇）裂解10 min，用酶标仪在690 nm波长处测定吸光度，计算细胞吞噬活性。

1.3.6 一氧化氮合酶的测定

取对数生长期细胞按照3×106cells/孔的数目接种到24孔板中，同1.3.5的设置组别及操作步骤，置于培养箱中培养24 h后收集细胞，利用100 μL超纯水反复冻融细胞3次，12000 r/min离心10 min，取上清液，利用 BCA试剂盒测定细胞全蛋白的含量，用于NOS的检测，同时用一氧化氮合酶试剂盒按照说明书操作，测定吸光值并换算成 NOS酶活力值[17]。酶活力单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成1 nmol NO为一个酶活力单位。

式中：

ODNOS——总NOS测定OD值；

OD空——空白OD值；

V总——反应液总体积；

V样——取样量；

r——比色光径；

t——反应时间；

C——待测样本蛋白浓度。

1.3.7 细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的测定

取对数生长期细胞按照3×106个/孔的数目接种到6孔板中，同1.3.5的设置组别及操作步骤，置于培养箱中培养24 h后收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，测定各细胞因子的浓度水平[18]。

1.3.8 数据处理

使用DPS软件对数据进行方差分析，使用Duncan新复极差法并进行多重比较。

2 实验结果

2.1 榆黄菇粗多糖的 DEAE-Cellulose离子柱分离

榆黄菇子实体经过水提醇沉、去除蛋白后得到的粗多糖样品，多糖溶液经过透析调节pH值后上样于DEAE-Cellulose层析柱，分别利用 0、0.2、1 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，分别在0和0.2 mol/L NaCl溶液洗脱时获得2个含量较高的洗脱峰D1和D2，洗脱曲线如图1所示。

2.2 榆黄菇多糖的Superdex-75凝胶柱层析结果

D1和D2组分分别采用Superdex-75凝胶柱层析进行分离，D1和D2组分经过凝胶过滤分离后呈现出单峰，说明已获得多糖提纯品，分别命名为 PSI和PSII，洗脱曲线见图2和图3所示。

2.3 LPS诱导巨噬细胞建立炎症模型

TNF-α是细胞产生炎症反应的始发因子，当一定浓度的LPS刺激巨噬细胞RAW264.7后能使细胞过量且持续地产生TNF-α引起炎症反应，由图4可以看出，当LPS浓度为5 μg/mL时，细胞分泌TNF-α含量水平最高，所以我们后续研究选择LPS浓度为5 μg/mL作为炎症诱导浓度。

由图4可知，RAW264.7巨噬细胞在LPS的诱导下释放炎性因子TNF-α的水平明显增高，LPS浓度为5 μg/mL时，释放炎性因子TNF-α的水平达到最高值，因此设定其为诱导炎症模型的最佳浓度。

2.4 榆黄菇多糖对RAW264.7细胞活力的影响

经不同浓度的榆黄菇多糖作用与被LPS刺激过的RAW264.7细胞培养24 h后，PSI浓度过高和过低时，细胞存活率出现下降的趋势（p＜0.05），说明过高浓度的PSI对RAW264.7细胞具有毒性，浓度过低可能使细胞产生过激炎症反应发生凋亡，但在 PSI为 500 μg/mL细胞存活率最大，为206.08%，虽然未与LPS处理组形成显著性差异，但是该作用浓度是PSI刺激细胞增殖的最佳剂量。同理，可筛选出 PSII浓度为200 μg/mL时细胞存活率最大，为210.86%，后期我们选择榆黄菇多糖PSI浓度为500 μg/mL和PSII浓度为200 μg/mL两个剂量对LPS诱导的炎症细胞进行抗炎症功能的研究。

2.5 中性红试验观察细胞吞噬活性

由图7可知，与空白组相比较，以空白组的吞噬率 100%作为参照，炎症组的细胞吞噬率增加了68.13%，由此可见巨噬细胞在受到LPS的刺激后其吞噬能力显著性增加（p＜0.05）；与炎症组相比，多糖纯品 PSI的浓度为 500 μg/mL时的细胞吞噬率减少14.91%；多糖纯品PSII的浓度为200 μg/mL时细胞的吞噬率减少17.84%，说明500 μg/mL多糖PSI和200 μg/mL的 PSII都具有显著性减少细胞吞噬能力作用（p＜0.05），可以缓解LPS对巨噬细胞的刺激作用。

2.6 一氧化氮合酶的测定

如图8测定PSI和PSII对炎症细胞NOS酶活力的影响，与炎症组中NOS浓度相比较，多糖PSI和PSII对巨噬细胞 NOS的活性抑制率分别 37.54%、51.24%，多糖 PSI和 PSII能显著性降低 NOS水平（p＜0.05）。

2.7 细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的测定

由图9所示，利用最佳浓度的PSI和PSII组分处理RAW264.7炎症细胞24 h后，测定IL-1β的含量，与炎症组相比较，多糖PSI和PSII组的IL-1β的含量分别为分别降低了28.84%和37.56%，说明多糖纯品PSI和PSII均能显著性降低炎症细胞分泌IL-1β的水平（p＜0.05）。

由图10可知，炎症组与空白组的IL-6含量相比较增加了162.19%，存在差异显著（p＜0.05）；炎症组分别与PSI和PSII组IL-6的含量相比较，PSI组IL-6的分泌水平的抑制率为28.27%，PSII组IL-6分泌水平的抑制率为31.35%，说明PSI和PSII都能显著性降低炎症细胞的IL-6的分泌水平（p＜0.05）。

如图11所示，利用最佳浓度的PSI和PSII组分处理RAW264.7炎症细胞24 h后测定TNF-α的含量，与空白组的相比较，炎症组的 TNF-α含量增加了86.54%，存在显著性差异（p＜0.05）；与炎症组比较PSI、PSII组的 TNF-α分泌水平的抑制率分别为30.25%、32.67%，存在显著性差异（p＜0.05）。

3 讨论

巨噬细胞在炎症反应中具有关键的作用，其能够通过促进机体免疫系统释放炎症介质来参与炎症反应[19]。LPS作为一种细胞毒素，对巨噬细胞具有一定的激活作用，刺激巨噬细胞产生NO和释放细胞免疫因子等生物活性物质，适量的免疫因子具有提高机体抵抗外界刺激和修复机体损伤的作用，而过量持续的刺激产生的免疫活性物质则会引起细胞的炎症反应，导致细胞的损伤和凋亡[20]。

TNF-α、IL-6和 IL-1β作为主要细胞因子，在机体免疫应答和炎症调节中发挥着重要作用。TNF-α是一类在炎症调控中占据主导地位的双重活性细胞因子，正常的机体可以适量的分泌TNF-α，其可以介导免疫应答，增强巨噬细胞的杀伤活性，进而增强机体的免疫机能。但是当TNF-α大量释放的时候，其能够诱导其它炎性介质和氧自由基的分泌，加剧炎症发展的进程[21]。IL-6能调节各种生理过程，包括应急反应、炎症、免疫反应、造血和细胞生长等，它通过促进嗜中性粒细胞运输到炎症部位而参与炎症的引发和维持，导致产生许多炎症介质，还可调节T淋巴细胞的激活和分化，促进B淋巴细胞成熟[22]。IL-1β是一种淋巴细胞及单核细胞激活因子，作用于机体的各个系统，参与免疫调节、介导炎性反应、影响组织代谢，诱导其它多种细胞因子的分泌，是炎性反应过程中重要的细胞因子之一[23]。一氧化氮合酶（NOS）是一种同工酶，分别存在于内皮细胞、巨噬细胞、神经吞噬细胞及神经细胞中，在免疫反应过程中，内毒素和某些细胞因子如IL-1、TNF-α、干扰素等可诱导NOS酶催化L-精氨酸产生大量NO，对肠黏膜具有杀伤毒性和促炎作用。

本实验以榆黄菇多糖为活性物质，在体外抗炎研究中发现，多糖提纯品PSI和PSII处理RAW264.7炎症细胞24 h后，利用MTT法测定细胞存活率来筛选出促增殖活性最佳剂量分别为 500 μg/mL和 200 μg/mL，云少君等[24]通过使用MTT法检测巨噬细胞的增殖发现巴氏蘑菇多糖在浓度为1000 μg/mL时效果最佳，相对比，榆黄菇多糖抗炎效用明显优于巴氏蘑菇多糖。研究通过测定巨噬细胞的吞噬能力来发现抗炎功效，与炎症组比较，经过500 μg/mL多糖PSI处理后，细胞的吞噬能力减少了15.05%；经过200 μg/mL的PSII处理后，细胞的吞噬能力减少了17.82%，说明多糖PSI与PSII具有良好的抗炎功效；在抗炎功效研究中，与炎症组相比，经过500 μg/mL PSI处理后的炎症细胞，其NOS活性减少了37.54%，细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平分别下降了29.25%、28.34%和30.27%；而经过200 μg/mL PSII处理后的炎症细胞，其NOS活性减少了51.24%，细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平分别下降了38.54%、31.45%和32.76%。这一结果说明了多糖PSI与PSII可通过降低炎症细胞因子的分泌，抑制其诱导炎性介质的能力；同时多糖PSI与PSII还有效抑制炎症细胞NOS酶的活力，降低其促炎作用，从而达到抗炎的效果。董瑛等[25]的研究发现，香菇多糖联合GP化疗方案对于促炎性细胞分子 IL-1β、TNF-α的分泌具有良好的抑制作用，抑制率达到了46.66%，相比较PSI和PSII对于促炎性细胞分子 IL-1β、TNF-α的分泌也具有明显的抑制作用，其中单独使用PSII就可以抑制细胞分泌IL-1β达到38.54%，抑制率与香菇多糖和化疗药物联合应用的效果相近，说明其作用优于香菇多糖。另外，多糖被公认为是生物免疫反应调节剂，具有无毒的特性，与当前广泛研究的抗炎醛类物质相比，其具有更为广泛的应用前景。本研究发现榆黄菇多糖 PSI和PSII可以调节巨噬细胞增殖和吞噬能力，从而发挥抗炎的功能，这与欧阳学农等[26]研究香菇多糖抗炎的作用机理相吻合。

4 结论

本研究从榆黄菇中提取得到PSI和PSII两个多糖提纯品，通过体外细胞炎症模型的评价，确定了两个多糖提纯品能够缓解细胞的炎症反应，具备抗炎功能。其中低作用浓度的PSII对于细胞NOS的活性和细胞因子分泌的抑制作用更为明显，其作用效果优于PSI，该研究结果可以为榆黄菇多糖在抗炎功能研究及应用方向提供科学支持。