李芳，陈绍基，谭纯，梅四鹏，贾红菓，周荣琼

西南大学 动物医学院，重庆 荣昌 402460

犬弓首蛔虫Toxocaracanis是一种寄生在犬及犬科动物小肠内的寄生虫，其感染性虫卵或幼虫是弓首蛔虫病(Toxocariasis)的病原体[1]．弓首蛔虫病是一种人兽共患寄生虫病，人和其他哺乳动物主要通过意外摄入含有T.canis感染性幼虫或虫卵的食物而感染[2]．作为非特异性宿主，人感染后感染性虫卵可以在小肠内发育成为L2幼虫，但不能发育为成虫，L2幼虫穿过宿主小肠壁黏膜，通过循环系统移行进入机体肺脏、肝脏、肌肉和大脑等各种器官、组织中，造成器官和组织的损伤，引发宿主的免疫和炎症反应[3-4]，从而出现不同的临床症状，如隐性弓首蛔虫病(covert toxocariasis，CT)、神经弓首蛔虫病(neurological toxocariasis，NT)、内脏幼虫移行症(visceral larva migrans，VLM)及眼睛幼虫移行症(ocular larve migrans，OLM)等[5-6]，严重危害人类的身体健康．

磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)是一个高度保守的多功能碱性胞质蛋白，其表面具有一个狭窄的空腔，是重要的配体结合位点，可结合膜磷脂、核苷酸、三磷酸腺苷等多种物质，参与维持细胞稳态，调节细胞分化、迁移和黏附等多种生物学功能[7-9]．在寄生虫中，磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)可参与细胞的生长、发育、繁殖和信号传导等．如寄生恶性疟原虫PEBP能促进虫体的生长、发育和繁殖等[10-11]；肝片吸虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白通过与CD14受体进行结合来抑制p38蛋白、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和应激活化蛋白激酶(JNK)的磷酸化，从而抑制LPS诱导的炎性反应，具有免疫调节特性[12]．犬弓首蛔虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白(Tc-PEPB)的研究未见报道，本研究通过克隆、鉴定Tc-pebp全长基因，采用qRT-PCR技术对犬弓首蛔虫各组织进行转录差异水平分析，以期为探讨Tc-PEBP蛋白的功能奠定基础．

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 犬弓首蛔虫样本

犬弓首蛔虫虫体样本采自西南大学动物医学院动物医院某患病犬．虫体用37 ℃灭菌的生理盐水洗涤去除杂质后，经形态学鉴定，将成熟的T.canis雌虫卵巢进行解剖，收集虫卵，在37 ℃培养箱中培养3～4周后，虫卵发育为L2期幼虫[13]．

1.1.2 主要试剂

DH5α、EasyPure©胶回收试剂盒购自TransGen Biotech(全式金)公司；T-Vector pMD19(simple)、PrimeScriptTM反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司；Trizol试剂购自Invitrogen(赛默飞)公司．

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取与反转录

通过形态学和分子生物学的方法对雌、雄虫进行鉴定，解剖和分离雌、雄虫的肠道，肌肉，体壁，生殖道等各个组织．取出液氮提前预冷研钵，分别加入雌、雄虫体各组织和L2幼虫，在液氮中充分研磨成粉末．取研磨好的粉末放入无RNA酶离心管中，使用传统的Trizol法分别提取犬弓首蛔虫成虫、L2期幼虫及各组织的RNA；采用Eppendorf核酸蛋白测定仪检测得到总RNA的浓度和纯度．以提取的T.canis及各组织的总RNA为模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒说明书来反转录合成cDNA，-20 ℃保存．

1.2.2Tc-pebp基因的克隆及分析

(1)引物的设计与合成

根据Tc-PEBP全长基因序列(GenBank No：AAC46843.1)，用Primer Premier 6.0 和Primer-BLAST软件设计基因特异性引物并克隆其完整编码序列．引物序列信息为F：5’-TTAGGCCTGCGATCGATAGAA-3’；5’-AAGATAGCTAGCGTCCGGATT-3’．引物序列送擎科兴业生物技术有限公司(重庆)进行合成．

(2)Tc-pebp基因的PCR扩增

以反转录合成的T.canis成虫及L2期幼虫的cDNA为模板，进行PCR扩增．扩增体系为50 μL：上、下游引物(10 μM)各1 μL；Mg2+(25 mM)5 μL；10×PCR buffer(不含Mg2+)4.0 μL；dNTPs(2.5 mM)4 μL；模板(cDNA)2 μL；r×Taq酶(5 U/μL)1 μL；dd H2O 32.0 μL[14]．

PCR反应条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min，扩增产物置于4 ℃保存．

(3)克隆及测序

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，按照EasyPure©胶回收试剂盒说明书对目的PCR产物进行回收．将回收得到的目的基因片段与pMD19-T(simple)载体进行连接，并转化至DH5α感受态细胞中．在37 ℃ 220 r/min的条件下震荡培养60～90 min，培养结束后使用“L”型涂菌棒涂布于LB/Amp+固体培养基上(含有X-Gal和IPTG)，在37 ℃恒温培养箱静置30 min后倒置，过夜培养12～16 h．培养结束后，在平板上用接种环挑取单个白色菌落于含有900 μL LB/Amp+液体培养基的EP管中，在37 ℃ 220 r/min的摇床中过夜培养14～16 h．

(4)序列分析

重组菌液经PCR鉴定为阳性菌液的，将其送至擎科兴业生物技术有限公司(重庆)进行测序．将测序结果通过生物大分子序列比对搜索工具(BLAST)进行同源性比对；登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站查找Tc-PEBP蛋白序列，并使用MAFFT，Clustal Omega和MUSCLE等软件对Tc-pebp基因进行多重序列比较，通过使用MEGA 7.0软件中的邻接法(Neighbour-joining，NJ法)来对Tc-PEBP蛋白序列进行系统发育进化树的构建，用Bootstrap对进化树的可靠性进行分析，共1 000个重复；并使用蛋白数据库SMART、PORTER和I-TASSER等软件预测Tc-PEBP蛋白的二级结构和功能结构域．

1.2.3Tc-pebp基因的组织表达分析

根据T.canis基因组数据 (GenBank：AAC46843.1 )，用Primer Premier (Version 6.0 )软件设计特异性引物并克隆其完整编码序列，引物序列信息为F：5’-CGCATGTCAGTTGTACACAAA-3’，R：5’-GGTTAGGCCTGCGATCGATAGAA-3’．以18S 1：5’-AAAGGGCAGGGACGTAGTCAA-3’；18S 2：5’-AATTGTTGGTCTTCAACGAGGA-3’作为内参基因[15]．引物序列由擎科兴业生物技术有限公司(重庆)合成．

以雌、雄虫的肌肉、体壁、肠道及生殖道等各组织的cDNA为模板，分别用Tc-PEBP和18S rRNA引物进行实时荧光定量PCR．反应体系为50 μL：包括25 μL的SYBR Premix Ex Taq I；4 μL的 cDNA；上、下游引物各 2.0 μL；17 μL的ddH2O．PCR反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火32 s，共40个循环，循环结束后收集数据进行分析．

M：2 000 bp DNA相对分子质量标准； 1.雄虫；2.雌虫；3.L2期幼虫；4.阴性对照．图1 Tc-pebp基因的PCR扩增结果

2 结果与分析

2.1 Tc-pebp基因的克隆及鉴定

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，Tc-pebp在约800 bp处可见相应条带，与理论大小相符；阴性对照没有条带出现(图1)．将测序获得的碱基序列进行分析，结果显示Tc-pebp基因的完整编码区序列为789 bp，该序列含有一个完整编码区，共编码262个氨基酸，预测蛋白相对分子质量为2.6×104，功能结构域分析结果显示1～20个氨基酸为信号肽，第22～58位、第59～94位为2个重复的ShKT结构域，第123～257位有PBP保守结构域(图2)．

图2 Tc-PEBP蛋白的结构域预测

2.2 多重序列比对及种系发育分析

通过WormBase ParaSite[16]和GenBank检索，将Tc-PEBP蛋白氨基酸序列与4个线虫的PEBP蛋白氨基酸序列进行多重序列比对．这些序列分别是猪蛔虫Ascarissuum(GenBank No.AEUI03000057.1)、贝拉中杆线虫Mesorhabditisbelari(GenBank No.UZWA01000301.1)、秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans(GenBank No.NP_001300105.1)、异尖线虫Anisakissimplex(GenBank No.UYRR01001265.1)，结果发现均具有PBP保守结构域(图3)．

图3 Tc-PEBP蛋白氨基酸序列多重比对

将Tc-pebp编码的氨基酸序列与通过WormBase ParaSite[16]和GenBank收录的十二指肠钩虫Ancylostomaduodenale(GenBank No.KIH55180.1)、猪蛔虫A.suum(GenBank No.AEUI03000057.1)、秀丽隐杆线虫C.elegans(GenBank No.NP_001300105.1)、有齿食道口线虫Oesophagostomumdentatum(GenBank No.KHJ93726.1)、贝拉中杆线虫M.belari(GenBank No.UZWA01000301.1)、异尖线虫A.simplex(GenBank No.UYRR01001265.1)、中华按蚊Anophelessinensis(GenBank No.KFB38652.1)、家蝇Muscadomestica(GenBank No.AFP60570.1 )、环纹背带线虫Teladorsagiacircumcincta(GenBank No.PIO76166.1)、致倦库蚊Culexquinquefasciatus(GenBank No.EDS31592.1)、锡兰钩虫Ancylostomaceylanicum(GenBank No.EPB80812.1)、毛首鞭形线虫Trichuristrichiura(GenBank No.CDW52734.1)和猪鞭虫Trichurissuis(GenBank No.KHJ46160.1)进行多重序列比对并构建进化树，结果发现Tc-PEBP与贝拉中杆线虫M.belari(GenBank No.PRJEB30104)形成一个单独的分支，其进化关系较近(图4)．

图4 Tc-pebp编码氨基酸序列的系统发育关系分析

2.3 结构及功能预测

利用I-TASSER构建Tc-PEBP蛋白的三维空间，其TM最高值为0.69±0.12，标准差为6.3±3.8Å(图5a)．根据I-TASSER显示的空间结构及功能注释，发现Tc-PEBP蛋白的结合位点为D159，F162，R173，H175，S198，T199，P200，H207和Y209(图5b)．酶活性位点为G129，A165和T241(图5c)．基因本体论注释表明Tc-PEBP蛋白的分子功能为结合磷脂酰乙醇胺(GO：0008429)，生物学过程为调控有丝分裂(GO：0045840)和蛋白磷酸化(GO：0001933)，细胞组分为粗面内质网的必要组分(GO：0005791)．

图5 Tc-PEBP蛋白的结构和功能预测

2.4 Tc-pebp的组织差异表达

使用18S rRNA引物作为内参基因，对T.canis雌、雄虫的肌肉、体壁、肠道及生殖道等各个组织中Tc-pebp基因的转录水平进行分析，结果发现在雌虫的卵巢、输卵管、子宫、体壁、肠道和肌肉中均检测到Tc-pebp基因的表达，其中卵巢的转录水平最高，其次是输卵管，肌肉最低(图6a)；雄虫的Tc-pebp基因在肠道中表达量最高，在贮精囊中转录水平较低(图6b)．

图6 犬弓首蛔虫Tc-pebp组织差异表达分析

3 结语

磷脂酰乙醇结合蛋白(PEBP)在许多生理和病理过程中有着重要的作用．如在哺乳动物体内，PEBP作为一种内源性Raf-1激酶抑制蛋白，可通过抑制细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路的激活并与核转录因子-κB(NF-κB)上游信号分子进行结合，从而参与细胞的增殖、迁移、分化和机体的免疫防御反应等[17-19]．在植物体内，PEBP蛋白能够长距离运输，在顶端分生组织中诱导植物的开花并调控植物的生长发育[20-22]．在昆虫体内，PEBP可抵御外界微生物的入侵，被证明与昆虫的先天免疫防御有关[23]．

本研究发现，Tc-PEBP具有ShKT结构域(ShKT domain)和PBP结构域(PBP domain)(图3)．ShKT结构域由6个保守的半胱氨基酸(SXC)组成，能够促进其他分泌蛋白如黏蛋白的形成和聚合，参与寄生虫的免疫逃避[24]．多重序列比对显示，Tc-PEBP与猪蛔虫A.suum、秀丽隐杆线虫C.elegans、贝拉中杆线虫M.belari、异尖线虫A.simplex等均具有保守的PBP结构域，但N，C末端的保守性较差，这可能与不同物种与小分子物质结合有关[25]．PEBP可通过与膜结合对脂质进行转运[26]，而T.canis中PEBP的结构和功能预测显示Tc-PEBP在脂质运输中具有一定的作用，这为今后Tc-PEBP的功能研究奠定了基础．

磷脂酰乙醇胺结合蛋白在寄生虫的生长、繁殖和胚胎发育过程中发挥着重要作用．在秀丽隐杆线虫中PEBP存在于虫体的肌肉、体壁、阴道等部位，推测其参与早期虫体的生长发育及外阴形态的发生[27]．在曼氏血吸虫中，磷脂酰乙醇胺结合蛋白分布于雌虫子宫、卵巢、输卵管等部位，表明其与虫体的发育繁殖有关[28]；在猪蛔虫体内，磷脂酰乙醇胺结合蛋白存在于雌虫的子宫、卵巢等生殖组织中，参与维持胚胎的稳态发育[29-31]．在本试验中，qRT-PCR结果显示雌虫体内Tc-pebp在卵巢中高量表达，说明Tc-pebp参与了T.canis雌虫的繁殖过程．此外，在T.canis雌、雄虫肠道中均检测到Tc-pebp的表达．Gobert等[32]在日本血吸虫体内发现磷脂酰乙醇胺结合蛋白也存在于成虫肠道中，主要起摄取、运输宿主体内脂质的作用，而Tc-pebp是否参与对虫体脂质的摄取、运输过程，有待后续进一步研究．