陈加辉，何 建，周 瑞，郑 楠

温州医科大学附属怡宁老年医院八病区，浙江温州 325000

暴发性心肌炎(fulminant myocarditis，FM)是急性心肌炎中最严重的一种，可导致严重的血流动力学障碍、急性心力衰竭，甚至猝死，死亡率高达40%～70%[1- 3]。暴发性心肌炎的病因多种多样，包括病毒感染、免疫和过敏因素。暴发性心肌炎的诊断很复杂，更倾向于临床诊断，而不是组织学或病理学诊断[4]。部分FM患者心电图表现为ST段抬高，酷似心肌梗死(myocardial infarction，MI)，常误诊为急性MI，而早期正确的诊断可能有助于治疗，并降低死亡率。目前的实验室检查如肌钙蛋白I或T、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、脑利钠肽等被用于心血管疾病的临床诊断。然而，这些生物标志物的表达水平在心肌损伤和心功能不全期间变化很大，对暴发性心肌炎的诊断缺乏特异性。因此，迫切需要新的具有更高灵敏度和特异度的生物标志物来诊断暴发性心肌炎。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种小的非编码RNA，通过与靶miRNA的3’端非编码区结合而导致基因沉默，在多种疾病中发挥重要作用。有研究表明，miRNA可能以稳定的形式存在于血浆或血清中，某些循环中的miRNA，如miR- 29b、miR- 125b和miR- 22，在心力衰竭中起着重要作用，可作为预测心力衰竭的生物标志物[5- 9]。循环中的miR- 125b是心脏骤停后生存期的独立预测因子[9]。然而，循环miRNA是否可以作为成人FM的生物标志物尚不清楚。本研究旨在研究FM患者外周血中miRNA的表达谱特征，并寻找可能用于FM诊断的生物标志物。

对象和方法

对象随机数字表法选取2019年6月至2020年6月在温州医科大学附属怡宁老年医院入院的10例FM患者、10例MI患者和7名健康受试者为研究对象。FM组患者纳入标准：(1)经临床诊断为FM患者；(2)急性心力衰竭在2周内迅速出现症状；(3)严重血流动力学损伤；(4)早期(入院第1～2 d)使用机械循环支持，如主动脉内气囊反搏和/或静脉-动脉体外膜肺氧合。排除标准：经冠状动脉造影确诊为急性MI。MI组患者纳入标准：符合第4版MI全球定义中关于急性MI的诊断标准，包括典型的胸痛等心肌缺血症状、心电图动态演变、心肌标志物异常增高等[2]。排除标准：(1)年龄<12岁；(2)无法进行冠状动脉造影以区分FM和MI的患者；(3)因脓毒症、化疗药物或毒物引起的心肌损伤；(4)血流动力学不稳定或低血容量引起的休克；(5)患有先天性心脏病、瓣膜性心脏病；(6)严重肝肾功能不全。健康对照组纳入标准：无高血压、冠心病、风湿性心脏病及原发性心肌病史，亦无药物性、中毒性、代谢性、胶原病等所致的其他特异性心肌病史。排除标准：(1)年龄<12岁；(2)妊娠期或哺乳期。本研究通过温州医科大学附属怡宁老年医院伦理审查委员会审批(伦理审查编号：K20190218)，所有患者均签署知情同意书。

miRNA微阵列分析获取受试者的血浆样本并提取RNA用于miRNA微阵列分析。采用TRIzol LS(Invitgen，USA)提取总RNA后使用RNasy mini试剂盒(擎科生物技术有限公司)纯化，NanoDrop ND- 1000测定仪测定RNA的含量和质量，检测RNA在260 nm和280 nm处的吸光度比值，采用Agilent miRNA全标记芯片系统和Hyb试剂盒(安捷伦生物有限公司)进行miRNA微阵列样品标记和阵列杂交，使用安捷伦微阵列扫描仪清洗、固定和扫描杂交阵列。将扫描图像导入Axon GenePix Pro 6.0软件进行网格对齐和数据提取。

实时定量PCR方法检测miRNA表达在7900HT快速实时荧光定量PCR系统(Life Technologies，USA)上检测miRNA的表达，定量PCR设置：95℃ 10 min、95℃ 10 s、60℃ 10 s和72℃ 15 s，40个循环，miRNA引物由格鲁斯特生物技术有限公司设计合成，以U6为标准通过2-ΔΔCt相对定量方法计算相对表达水平。

生物信息分析通过TargetScan(http：//www.targetscan.org/vert_72/)预测miRNA的靶基因，使用David生物信息资源(https：//david.ncifcrf.gov/)对所选基因进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

体外实验人心肌细胞系H9C2购自美国ATCC细胞库，在含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞接种到24孔板，将miR- 29b模拟物(miR- 29b mimic)、miR- 125b模拟物(miR- 125b mimic)，模拟物阴性对照物(NC mimic)转染H9C2细胞，未转染组细胞使用PBS进行处理(溶剂对照组)，并设置未做任何处理的对照组，24 h后收集H9C2细胞及其上清液进行相关分析。使用ELISA试剂盒(阿拉丁试剂有限公司)检测H9C2细胞上清液中白细胞介素(interleukin，IL)- 1β、IL- 6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、IL- 10水平。CCK- 8法检测细胞活力。通过蛋白免疫印迹分析蛋白表达。流式细胞术用于分析细胞凋亡。

统计学处理采用SPSS 20.0统计软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。对非正态分布的变量进行Mann WhitneyU检验，相关性分析采用Pearson检验，通过受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析miRNA对FM的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一般情况FM患者中男性7例、女性3例，平均年龄(37.8±4.32)岁；发热4例，胸闷3例，胸痛3例；肌钙蛋白(37 652.85±3472.62) pg/ml，脑钠肽(9938.63±1305.72) pg/ml，白细胞(9.36±2.31)×109/L，中性粒细胞(8.32±1.78)×109/L，丙氨酸转氨酶(178.35±23.16) U/L，天冬氨酸转氨酶(447.29±56.93) U/L；MRI检查显示6例心肌水肿；患者中6例采用主动脉内球囊反搏(intra-aortic balloon pump，IABP)，4例采用体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ECMO)，4例采用连续性肾脏替代治疗(continuous renal replacement therapy，CRRT)，1例采用抗病毒糖皮质激素进行治疗。MI患者中男性6例、女性4例，平均年龄(36.09±5.08)岁。健康受试者中男性4例、女性3例，平均年龄(35.23±5.12)岁。

循环miRNA图谱miRNA微阵列分析结果显示，所有受试组共检测到1325个miRNA。与健康对照组相比，FM患者组hsa-miR- 29b(t=6.926，P=0.018)、hsa-miR- 125b(t=8.218，P=0.003)和hsa-miR- 200c- 3p(t=6.335，P=0.026)表达显著上调，而hsa-miR- 142表达显著下调(t=9.536，P=0.001)。与健康对照组相比，MI患者组hsa-miR- 29b(t=11.257，P<0.001)、hsa-miR- 200c- 3p(t=2.084，P=0.502)和hsa-miR- 142(t=3.017，P=0.218)的表达水平差异无统计学意义，而hsa-miR- 125b的表达水平明显升高(t=9.861，P=0.001)。

实时定量PCR对miRNA表达的检测与健康对照组相比，FM患者组血浆中miR- 29b(t=18.925，P<0.001)、miR-125b(t=5.981，P=0.029)和miR- 200c- 3p(t=6.044，P=0.027)的表达水平显著上调，miR- 142的表达水平显著下调(t=14.996，P<0.001)；而MI组血浆中仅miR- 125b的表达水平显著上调(t=5.329，P=0.031)(图1)。

与治疗前相比，治疗后FM患者组左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)显著增加(t=8.206，P=0.003)，而N末端B型利钠肽前体(N-terminal B-type natriuretic peptide precursor，NT-proBNP)(t=7.154，P=0.019)和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin I，cTnI)(t=6.026，P=0.028)的表达水平显著下降。治疗后FM患者组miR- 29b(t=12.943，P<0.001)和miR- 125b(t=14.016，P<0.001)的表达水平显著下调，恢复至正常水平；而miR- 200c- 3p(t=1.996，P=0.401)和miR- 142(t=2.752，P=0.392)的表达水平与治疗前相比差异无统计学意义。

KEGG通路分析潜在的生物标志物对miRNA的靶标进行KEGG通路分析，结果显示，miR- 29b靶点参与多种途径，尤其是炎症反应和细胞凋亡途径，如T细胞或B细胞受体、肿瘤坏死因子、白细胞跨内皮细胞迁移、趋化因子信号通路，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/苏氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase，AKT)通路等；miR- 125b靶点参与细胞生存相关的通路，如凋亡、血管内皮生长因子和PI3K-AKT通路(图2)。

FM：暴发性心肌炎；MI：心肌梗死

miR- 29b和miR- 125b的生物学作用ELISA检测结果显示，与对照组相比，miR- 29b模拟物和miR- 125b模拟物转染后可明显上调IL- 1β(t=8.217，P=0.003；t=7.981，P=0.009)、IL- 6(t=16.817，P<0.001；t=8.725，P=0.001)、IL- 10(t=8.106，P=0.007；t=8.992，P=0.001)、TNF-α(t=14.925，P<0.001；t=11.367，P<0.001)的表达水平(图3A)。细胞增殖与凋亡检测显示，与miR- 125b模拟物相比，转染miR- 29b模拟物对心肌细胞凋亡的诱导作用更加明显(χ2=6.168，P=0.047)，而两组细胞增殖抑制情况差异无统计学意义(χ2=1.452，P=0.417)(图3B、C)。蛋白免疫印迹分析显示，与对照组相比，miR- 29b模拟物和miR- 125b模拟物转染后可上调凋亡相关蛋白Bax和活化的半胱天冬酶- 3(cleaved casepase- 3，CCS- 3)的水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl- 2和增殖蛋白C-myc的表达(图3D)。

循环miRNA表达与FM严重程度的相关性线性相关分析显示，miR- 29b和miR- 125b表达水平与LVEF呈负相关(r=-0.67，P=0.071；r=-0.49，P=0.003)，与cTnI浓度(r=0.61，P=0.019；r=0.52，P=0.016)、干扰素β(interferon β，IFN-β)浓度(r=0.42，P=0.014；r=0.36，P=0.021)以及心肌水肿面积(r=0.86，P=0.005；r=0.73，P=0.013)呈显著正相关。

miR- 29b和miR- 125b的诊断准确性绘制并分析ROC曲线，结果显示，miR- 29b诊断FM的曲线下面积(area under curve，AUC)为0.872，miR- 125b诊断FM的AUC为0.825，两者差异无统计学意义(t=2.654，P=0.218)。与miR- 125b相比，miR- 29b具有较高的灵敏度(93.6%比89.2%；t=0.896，P=0.795)和特异度(72.4%比.59.6%；t=9.478，P=0.002)(图4)。

讨 论

FM发病急、进展快，可导致严重心力衰竭甚至猝死。及时、准确的诊断是挽救生命的关键[9]。目前，诊断可疑心肌炎的生物标志物有限，纳入包括病史、临床症状和实验室检查的综合策略有助于提高FM诊断的准确率。有文献报道，当患者出现起病突然、病毒感染首发症状明显(如发热、咳嗽、胃痛等)、迅速出现严重血流动力学障碍、心肌损伤严重、室壁运动弥漫性减弱等症状时，可作出FM的临床诊断[1- 3]。而按照Louise标准临床诊断为FM时，组织学特征表现为细胞内和间质水肿、充血、毛细血管渗漏以及细胞坏死和纤维化，当基于组织学特征表现中有2个或2个以上为阳性时，预测FM的诊断准确率为78%～82%。在本研究中，FM的诊断主要基于中国心脏病学会专家共识声明和国际心肌炎心血管磁共振共识小组声明中的临床症状和心血管磁共振表现[4]。

FM是一种进展迅速的疾病，需要早期快速诊断，但目前可疑心肌炎的诊断生物标志物有限。近年研究表明，miRNA在心血管疾病中发挥着重要作用，可作为多种疾病的诊断生物标志物[3- 9]。传统的实时定量PCR分析需要至少1.5 h才能检测到miRNA的表达，然而随着技术的进步，新的实时定量PCR方法和检测仪器可将检测时间缩短至30 min，为FM的快速诊断提供了基础[9- 10]。本研究对FM患者的血液样本进行miRNA谱分析，结果显示，FM患者循环miR- 29b、miR- 125b和miR- 200c- 3p的表达水平上调，当临床症状恢复后，miR- 29b和miR- 125b水平降至正常水平，提示其在FM中可能作为潜在的生物标志物。MiR- 29b与心肌功能密切相关，有文献报道牛磺酸上调基因1通过负性调节miR- 29b的表达而减轻脂多糖诱导的H9c2细胞损伤，促进H9c2细胞的存活而抑制细胞凋亡、炎症以及核因子κB和Janus激酶/信号转导与转录激活子信号通路的磷酸化激活[11]。本研究KEGG通路分析显示，miR- 29b靶点参与多种途径，尤其是炎症反应和细胞凋亡途径，且体外实验证实，使用miR- 29b模拟物转染心肌细胞后，心肌细胞损伤明显，心肌细胞中炎症因子的释放水平显著增加。另有研究指出CVB3病毒刺激可通过上调miR- 125b促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖的细胞凋亡，并抑制其靶基因Fas相关磷酸酶1的表达，从而在CVB3诱导心肌细胞凋亡中起决定性作用[12- 13]。miR- 125b靶点主要参与细胞生存相关通路，如凋亡、血管内皮生长因子等途径。综合上述结果，提示miR- 29b和miR- 125b靶基因主要参与炎症和免疫应答，初步表明miR- 29b和miR- 125b可能通过这些途径参与FM的发生。进一步的相关性分析显示，miR- 125b和miR- 29b在FM和MI患者血浆中的表达升高，且与LVEF值呈负相关，提示miR- 29b和miR- 125b的表达与心肌损伤有关。而miR- 125b与cTnI之间的相关性相对于miR- 29b较弱，可能是因为miR- 125b可来源于心肌细胞、内皮细胞或免疫细胞，而cTnI和miR- 29b主要来源于心肌细胞，且血浆中cTnI的高表达通常是由于心肌细胞的死亡，如心肌梗死后的凋亡和坏死所致。此外，ROC曲线分析显示，miR- 29b对FM诊断具有较高的灵敏度和特异度。

图2 miR- 29b靶基因(A)和miR- 125b靶基因(B)的KEGG通路分析图

IL：白细胞介素；Mr：相对分子质量；TNF-α：肿瘤坏死因子α；BAD：Bcl- 2相关死亡启动因子；CCS- 3：活化的半胱天冬酶- 3

图4 miR- 29b和miR- 125b诊断FM的受试者工作特征曲线

综上，本研究结果发现miR- 125b和miR- 29b在FM患者血液中的表达水平升高，且与FM严重程度呈正相关。此外，相较于miR- 125b，miR- 29b对FM诊断具有相对较高的灵敏度和特异度，可作为FM的潜在生物标志物。