孙国祝，路 萌，王决恒，周宇荀，李 凯，肖君华

(东华大学 化学化工与生物工程学院， 上海 201620)

线粒体拷贝数变异与许多年龄相关疾病有关，包括代谢综合征、神经退行性疾病、心血管疾病和癌症等。检测线粒体拷贝数变化对于揭示细胞衰老进程以及评估个体健康水平有重要意义[1]。荧光定量PCR(polymerase chain reaction)技术是目前主要检测线粒体拷贝数的方法，具有快速、高通量且易于使用和分析等优点[2-5]。多重荧光定量PCR技术要求内参基因和目的基因的拷贝数在相同数量级，从而保障检测结果的准确性。据文献[6]报道，每个细胞中含有几百至上千拷贝的线粒体DNA。本研究从基因组数据库中寻找一个高拷贝(300拷贝)基因作为内参基因，命名为YH-1。与单拷贝内参基因相比，高拷贝内参基因减少了与线粒体DNA拷贝数的倍数差异。同时，建立并优化了双色荧光定量PCR方案(双TaqMan探针法)来检测线粒体和内参基因的拷贝数，该方案实现了内参基因和目的基因在同一管中检测，提高检测结果的准确性，也可节约样本。线粒体DNA与基因组DNA共存于细胞中，不同于基因组DNA，线粒体DNA呈环状，两者长度大小悬殊，导致在总DNA抽提过程中会影响线粒体DNA得率，进而影响线粒体DNA拷贝数的检测。所以本文比较了琼脂糖包块法、磁珠法、试剂盒法以及酚-氯仿法等不同总DNA抽提方案对线粒体DNA拷贝数检测影响[7-8]，同时构建了稳定的质粒标准品用以检测方案。利用该方案，随机检测了不同年龄段100例血样，结果表明线粒体DNA拷贝数与年龄呈负相关。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DNA血样采集于上海松江区中心医院志愿者(所有研究参与者均在自主自愿的前提下签署了知情同意书)。7500 Real Time PCR System 购自美国 Applied Biosystems 公司;Probe qPCR Super Mix 购自近岸蛋白科技有限公司；磁珠法DNA提取试剂盒购自上海木辰生物科技有限公司；琼脂糖购自上海翊圣生物科技有限公司；柱式血样DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，酚-氯仿DNA提取试剂盒购自上海翼和应用生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

使用4种不同方法进行了细胞基因组DNA抽提：琼脂糖包块法、磁珠法、试剂盒法(过柱式)、酚-氯仿法等方法，操作步骤见相关说明书。

1.2.2 DNA样本标化

将上述4种不同提取方案所得DNA样品稀释至20 ng/μL，纯度A260/A280≈1.8，其中，A260为DNA吸光度，A280为蛋白质吸光度，取2 μL作为模板，进行荧光定量 PCR反应。

1.2.3 引物和探针设计

依照引探针物及探针设计原则，利用Prime 3.0和Oligo 7设计线粒体及YH-1特异性上下游引物及TaqMan探针。线粒体上游引物5′-CCGACCGTTGACTATTCT-3′、下游引物5′-CCGATTATGATGGGTATTACT-3′、YH-1上游引物5′-GAAAGTGAAGTAGGCCGGGC-3′、下游引物5′-GAAAGTGAAGTAGGCCGGGC-3；线粒体TaqMan探针5′CGCATGAGCTGGAGTCCTC-BHQ1-3′及YH-1TaqMan探针5′-CCACGCCTGTAATCCCAGC-BHQ1-3′。引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成，TaqMan探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成。YH-1经NCBI Blast比对结果显示，其拷贝数为300，全长为200 bp。

1.2.4 质粒标准品的制备

将外源内参基因YH-1与线粒体扩增片段连接到质粒pUC57上构建质粒标准品。

1.2.5 多重荧光定量 PCR反应检测线粒体拷贝数

多重荧光定量 PCR反应体系总体积为 20 μL，其中近岸蛋白2×ProbeMix10 μL，ROX dyeⅡ0.4 μL，引物浓度稀释至0.5 μmol/L，加样2 μL。探针浓度稀释至0.05 μmol/L，加样2 μL；标准品DNA或检测样本基因组DNA加样2 μL，加超纯水至20 μL。使用ABI7500 Real Time PCR System定量检测，反应条件为94 ℃预变性5 min；循环条件为95 ℃变性15 s，58 ℃ 退火2 min，72 ℃延伸1 min，在72 ℃收集荧光信号，进行40个循环。

1.3 试验数据分析

1.3.1 标准曲线的建立

利用ABI软件标准曲线建立功能，自动生成标准曲线。

1.3.2 线粒体拷贝数计算

应用绝对定量法计算线粒体DNA的拷贝数，如式(1)所示。

线粒体DNA拷贝数=300/2-ΔΔCt

式中：ΔΔCt=(Ct线粒体-Ct核)样品-(Ct线粒体-Ct核)质粒，Ct为实时荧光定量PCR过程中扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数; 300为内参基因YH-1的拷贝数。

1.3.3 统计学分析

使用GraphPad prism 5.0 软件进行数据统计学分析和绘图。

1.4 应用

对100例血液样本(男性、女性各50例，分为5个年龄组20～30、31～40、41～50、51～60、61～70岁，每个年龄组男性、女性各10例)通过琼脂糖包块法提取基因组DNA来检测线粒体拷贝数。

2 结果分析

2.1 高拷贝内参基因在人群中拷贝数稳定

为获得可靠、准确的检测结果，要求内参基因在人群中稳定且没有拷贝数差异。从基因组数据库中筛选出的一段200 bp的基因组片段(300拷贝)作为新的内参基因命名为YH-1，以100例人血液DNA样本为模板进行多重荧光定量 PCR扩增，利用单拷贝内参基因36B4验证该内参基因的稳定性。试验结果表明：YH-1基因在人群中拷贝数稳定(见图1)，两基因Ct值相差8.36，数值上符合拷贝数倍数差异；并且YH-1基因在男性和女性样本中与内参基因的差值(ΔCt)趋于相近。由此证明内参基因YH-1在X染色体上没有非特异性扩增(见图2)，可以作为稳定的内参基因。

图1 利用内参基因36B4验证YH-1基因在人群中稳定性

图2 YH-1基因在性染色体(X染色体)上扩增情况

2.2 多重荧光定量PCR检测线粒体的标准曲线建立

5个浓度梯度线粒体样品Ct值与样本质量的标准曲线如图3所示。由图3可知，线粒体Ct值与其质量呈较好的线性关系(r2=0.995)，且扩增效率为111.155%。标准曲线的线性回归方程为y=-3.081×lgx+23.677，其中，y为Ct值，x为线粒体标准品的质量，ng。

图3 多重荧光定量PCR检测线粒体拷贝数的标准曲线

2.3 细胞总DNA抽提方案比较

使用多重荧光定量PCR法检测样本线粒体DNA拷贝数，结果如表1所示。由表1可知：琼脂糖包块法能够高效抽提出样本总DNA，试剂盒法、磁珠方法次之，酚-氯仿抽提方案的效率最低；利用琼脂糖包块法抽提的样本线粒体DNA拷贝数最多，提示该方法抽提线粒体DNA得率最高。

表1 不同方案抽提基因组DNA结果

2.4 样本检测

利用本文方案测定了100名20～70岁受试者的血细胞中线粒体DNA的拷贝数，结果如图4所示。由图4可知，随着年龄的增长，线粒体拷贝数呈降低趋势。在40岁之前，男性和女性的线粒体DNA拷贝数随年龄变化没有明显的变化趋势；40岁之后，线粒体DNA拷贝数随年龄增长呈明显下降，并且，女性线粒体拷贝数在同年龄段中稍高于男性。

图4 线粒体DNA拷贝数与年龄的关系

3 结 语

本文设计了一种新型多重荧光定量PCR检测线粒体DNA拷贝数的方案，该方案首次选用稳定的多拷贝基因为内参，同时消除了检测内参基因与目的基因时的孔间差。试验结果表明，该检测技术简单易行、结果可靠，简化检测步骤以及节约样本，适用于群体样本检测。利用该方案检测了100例20～70岁受试者的血细胞中线粒体DNA的拷贝数，发现线粒体DNA拷贝数与年龄增长呈负相关。另外，不同的总DNA提取方法对线粒体DNA的得率也不同。研究发现，琼脂糖包块法抽提样本总DNA效果最好，更适用于后续线粒体DNA拷贝数检测研究。总而言之，更加精准的线粒体拷贝数检测方法能够揭示线粒体拷贝数变化与衰老和疾病的关系，本文方法将为科研工作者提供一种更加可靠、方便的试验方案。