朱栋良 黎尉浩 严海东 尹小平 田晓玲

目前,针对结肠癌的主要治疗方案仍是以手术切除为主的综合治疗，晚期结肠癌、伴有远处转移或术后复发的结肠癌预后较差。以氟尿嘧啶及奥沙利铂为主的化疗药物能够一定程度上抑制肿瘤的生长，但效果有限，伊立替康及靶向药物西妥昔单抗等药物对于高转移性的结肠癌可以缓解疾病的进展，但较大的不良反应及靶向药物的耐药限制了其临床应用。目前，亟待开发新的更有效的靶向药物[1-2]。阿帕替尼(apatinib)是血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2)特异性小分子抑制剂，后者作为肿瘤内血管生成的关键调控因子，在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用[3-4]。我们以人结肠癌细胞SW480作为研究对象，研究阿帕替尼对于结肠癌侵袭能力的影响。

材料和方法

一、细胞及试剂

SW480人结肠癌细胞购自上海中科院生物研究所。实验用阿帕替尼由江苏恒瑞医药股份有限公司赠予。胎牛血清、DMEM培养基购自武汉启动子生物有限公司。抗E-cadherin抗体(CST,No.3195)，抗Vimentin抗体(CST,No.5741),抗Snail抗体(CST,No.3879)，抗Slug抗体(CST,No.9585)及抗内参GAPDH抗体(CST,No.5174)，预铺好Matrigel的Transwell(8um孔径)等其他耗材均购自美国康宁公司。

二、方法

1.细胞培养：SW480细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2温箱内培养，以0.25%胰蛋白酶消化传代。

2.细胞存活能力实验：不同浓度阿帕替尼处理后的SW480细胞，分别于0小时、48小时按照CCK-8试剂盒说明书，每孔加入10%的CCK8溶液，继续孵育4小时后，利用酶标仪在492 nM测定吸光度并绘制曲线，每组设5个复孔，实验重复3次。

3.细胞侵袭能力实验：将培养至对数生长的SW480细胞，用无血清DMEM培养基重悬，以每孔5×104的密度加入到预铺好Matrigel的Transwell小室上室内，下室加入600 ml完全培养液，分别加入阿帕替尼使其终浓度为60 nM、120 nM或阴性对照，培养箱中常规培养48小时取出上室，用4%多聚甲醛后0.01%结晶紫染色，200倍光学显微镜下计数穿膜细胞数，随即取5个视野，取平均值，每组实验设3个复孔，实验重复3次。

4.免疫印迹(Western blot)：检测120 nM阿帕替尼处理后SW480细胞中E-cadherin、Vimentin、Snail及Slug等MET相关蛋白水平的变化。收集细胞，加入适量NP-40裂解获取细胞总蛋白液，加入适量SDS上样缓冲液100 ℃水浴解交联。蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜转膜并用脱脂奶粉封闭非特异性结合，然后依次孵育一抗及二抗后ECL显色液显影，以GAPDH作为内参。

三、统计学方法

结果

1.阿帕替尼对SW480细胞存活能力的影响：在SW480细胞中加入不同浓度的阿帕替尼，观察其对细胞活性的影响，通过CCK8试剂盒检测细胞在492 nm波长下的吸光度。结果提示，当阿帕替尼的浓度≤120 nM时对SW480细胞的存活没有显著影响，而当阿帕替尼浓度≥180 nM时，对SW480细胞的存活有明显的抑制作用。本研究观察阿帕替尼对肿瘤细胞侵袭能力的影响，因此后文中主要选择60 nM及120 nM的阿帕替尼作为工具，以排除阿帕替尼对细胞增殖、生长的影响(图1)。

aP<0.05 vs Blank,bP<0.05 vs Vector,n=5

2.阿帕替尼对SW480侵袭能力的影响：观察60 nM及120 nM的阿帕替尼及阴性对照(Vector)处理48小时后的SW480细胞，计数穿过Matrigel的细胞数目以代表细胞的侵袭能力。结果提示，120 nM阿帕替尼处理后的穿膜细胞数为(34±7)个/视野，60 nM阿帕替尼处理后的穿膜细胞数为(46±6)个/视野，相比于阴性对照组(Vector)的(109±6)个/视野及空白对照组(Blank)的(112±4)个/视野显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图2 apatinib对SW480细胞侵袭能力的影响(龙胆紫染色×200)

3.阿帕替尼对MET相关蛋白表达的影响：将上述细胞裂解提取总蛋白后行Western blot检测发现，120 nM阿帕替尼处理后，SW480细胞中上皮性标志E-cadherin的蛋白表达明显升高，相对应的是间质性标志Vimentin的表达明显减少；同时检测了与MET相关的转录因子的表达，其中Snail、Slug的表达明显降低(图3)。

图3 apatinib对SW480中MET相关蛋白的影响

讨论

VEGF是一种重要的细胞因子，可由肿瘤细胞或肿瘤间质细胞所分泌，其作用于肿瘤细胞表面的VEGFR，可直接促进肿瘤细胞的增殖和生长，而作用于肿瘤中的间质细胞如血管内皮细胞，则可促进后者的增殖，而增强肿瘤的血管生成[5]。VEGF及VEGFR是目前公认的肿瘤分子靶向治疗的重要靶点。目前，针对于VEGF及VEGFR的靶向药物包括VEGF的单克隆抗体如贝伐单抗、VEGFR的单克隆抗体如雷莫芦单抗，以及本文所研究的针对VEGFR的酪氨酸激酶小分子抑制剂如阿帕替尼[5]。阿帕替尼目前已批准用于二线化疗药物无效及伴有远处转移的进展期胃癌的临床治疗，而在结肠癌、乳腺癌等其他上皮来源肿瘤中的研究正处于临床试验阶段。阿帕替尼主要作用于VEGFR2，后者是介导肿瘤血管生成的关键受体亚型，因此阿帕替尼延长晚期肿瘤病人生存期、改善生活质量的分子机制在于抑制肿瘤的血管生成[3-4]。而EMT及与其反向的MET是肿瘤转移的重要分子机制之一[6-7]，阿帕替尼是否能够影响肿瘤的EMT或MET过程，进而抑制肿瘤的侵袭转移尚不清楚。本文研究低剂量阿帕替尼对于结肠癌细胞侵袭能力的影响。

我们在结肠癌细胞株SW480中，加入不同浓度的阿帕替尼，观察到当阿帕替尼浓度≤120 nM时，阿帕替尼对SW480细胞的生长存活能力没有显著影响。我们通过预铺好Matrigel的Transwell小室模拟肿瘤转移时需要穿透的组织细胞基底膜，观察到阿帕替尼可减少SW480细胞的穿膜个数，即阿帕替尼抑制了SW480细胞的侵袭能力。我们发现，SW480细胞经阿帕替尼作用后细胞从长梭形变成椭圆形，伪足减少变短，细胞间隙也相应变小，而这些形态学改变是MET的特征表现。EMT及与其反向的MET作为一种复杂而且重要的生物学效应，广泛参与到多种病理生理进程，其中包括恶性肿瘤的侵袭转移[5-6]。阿帕替尼使细胞从转移能力较强的间质表型向转移能力较弱的上皮表型转化，从侧面解释阿帕替尼对SW480细胞侵袭能力的抑制作用。为了证实阿帕替尼通过使细胞发生MET从而抑制细胞的侵袭能力，我们利用Western blot检测阿帕替尼对细胞中MET相关蛋白如E-cadherin、Vimentin等蛋白水平的影响，结果发现，上皮标志E-cadherin表达升高，间质标志Vimentin表达降低，而作为调控MET的重要转录因子的Snail及Slug的表达也下降，提示阿帕替尼可能通过调控Snail、Slug抑制结肠癌细胞的侵袭转移。

综上所述，阿帕替尼可抑制结肠癌细胞株SW480发生MET，从而降低其侵袭转移的能力，阿帕替尼处理后SW480细胞中MET相关转录因子Snail、Slug的表达下降，提示Snail、Slug可能参与阿帕替尼介导的MET变化过程中。但阿帕替尼调控Snail、Slug的具体分子学机制尚待阐明。本研究提示，阿帕替尼可能参与结肠癌的发生发展。