王其霖 王李忻 单 航 谈荣想 罗 强 尹军霞

(绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000)

自然界中某些微生物可以通过其自身的生命活动，与周围环境介质之间不断循环发生酶化作用生成CO32-，并在有Ca2+存在的环境下形成具有胶结作用的方解石晶体，此类菌种为碳酸盐矿化菌[1].碳酸盐矿化菌在矿化过程中能形成具有胶结功能的碳酸盐，所以碳酸盐矿化菌可用于建筑裂缝的修复、水泥基材料表面的防护和加固，石质文物和景观的保护、沙基材料的胶结等[2]；碳酸盐矿化菌在沉积碳酸盐的过程中还能捕获放射性元素和重金属离子，可用其来修复和净化放射性元素、重金属污染的土壤或地下水[3-6]，王维大等的研究发现一株耐氰碳酸盐矿化菌还可固化含氰金矿尾渣中易迁移态的重金属铅向碳酸盐结合态转化[7]，碳酸盐矿化菌的研究具有广阔的应用前景.国内在碳酸盐矿化菌方面的研究起步较晚，且研究主要集中在较少的几种微生物上，很多研究者国外菌种保藏中心购买菌株用于研究，这大大制约了我国的碳酸盐矿化菌的开发应用.本研究试图从废弃建筑垃圾,建筑工地等环境中分离高效沉积CaCO3的碳酸盐矿化菌，为新的碳酸盐矿化菌资源的开发应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 样品来源

从绍兴周边建筑工地、房屋拆建以及重金属污染板结地等采集土壤样品.

1.2 培养基

富集培养基(g/L)：葡萄糖20，乙酸钠2，KH2PO42，NaCl5，尿素20，pH7.5；筛选培养基(g/L)：蛋白胨1，氯化钠5，磷酸二氢钾2，尿素2，葡萄糖0.1，0.2%的酚红溶液4 mL，琼脂20，pH7.5；种子培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠5，pH7.5；基础发酵培养基(g/L)：蛋白胨1，氯化钠5，磷酸二氢钾2，尿素2，葡萄糖0.1，pH7.5.

1.3 富集培养

取1 g土样接种到富集培养基中，30 ℃ 150 r/min摇瓶培养24 h.

1.4 菌种分离

将富集培养液用无菌水稀释至合适浓度,取合适的稀释液0.1 mL涂布至筛选培养基中,30 ℃培养48 h.

1.5 菌种初筛

挑取菌落周围变红色的菌株点种在筛选平板上，每个平板上点3处，30 ℃培养48 h，测量各平板菌落周围变色圈直径与菌落直径的比值并平均，选取变色圈和菌落直径比值大的菌株进行划线分离纯化后,接种至斜面培养24 h后4 ℃冰箱保存备用.

1.6 菌种复筛

挑取2环初筛菌株接种至100 mL的发酵培养基中,30 ℃，150 r/min培养48 h，每株菌平行接种2瓶.其中一瓶，加入3 g CaC12，混匀5 min，8 000 r/min离心10 min，去除上清液，在沉淀物中滴加稀盐酸，产生明显气泡的则说明沉淀为碳酸钙[8].另一瓶则用来检测菌株的碳酸钙沉积量和单位体积产率.

碳酸钙单位体积产率参考钱春香等的方法[9].碳酸钙沉积量参考竹文坤等的方法[10].

选取碳酸钙沉积量和碳酸钙单位体积产率较大的1株菌，进一步纯化3代后，斜面保藏备用.

1.7 菌种鉴定

菌种形态和生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[11]；16S rDNA测序参照李芸等的方法[12].

2 结果与分析

2.1 高效碳酸盐矿化菌的分离

从混合土样中分离到10株碳酸盐矿化菌，分别从1-10编号.

2.2 菌株的初筛

10株菌的初筛结果见表1.

表1 菌株的初筛结果

10株菌在平板上变色圈和菌落直径比值范围在1.53～2.60之间，说明10株菌都具有较强的碳酸盐矿化能力，选取比值超过1.70的2号、3号、5号、6号、7号5株菌进行复筛.

2.3 菌株的复筛

5株菌的培养沉淀物滴加稀盐酸后，离心管中均有大量的气泡产生，说明5株菌的沉淀物都含大量碳酸钙.具体复筛结果见表2.

表2 5株菌的碳酸钙沉积量和单位体积产率

5株菌中，2号菌的碳酸钙沉积量最高(0.303 g)，单位体积产率达12.8%，只比5号菌(命名为SZW5)的单位体积产率低0.5%(表2)，所以2号菌沉积碳酸钙的能力最强，将2号菌命名为SZW2，并对其进行鉴定.

2.4 菌株鉴定

2.4.1 形态特征

SZW2在筛选平板上培养两天后，整个平板由黄变红，菌落光滑，无色透明，直径约5 mm.革兰氏染色阴性，大小0.5～0.8 μm×1～2 μm，球杆状，单个、成双或短链状排列,见图1与图2.

图1 SZW2在筛选平板上的菌落形态

图2 SZW2革兰氏染色

2.4.2 生化特征(见表3)

表3 SZW2生理生化特征

2.4.3 16S rDNA测序和系统发育分析

由电泳图可见,扩增得到的目的片段长约1.5 kb左右,PCR反应体系无细菌污染(图3)，宝生物工程(大连)有限公司DNA测序,确定扩增的16S rDNA片段长度为1 451 bp，GenBank中核酸数据进行BLAST分析,利用ClustalX1.8.1进行比对,MEGA4软件按Neighbor-Joining法构建系统发育树如图4，图中可见菌株SZW2位于Klebsiellapneumoniae分支上,经同源性比较发现SZW2与Klebsiellapneumoniae(KY417867)的序列相似性达100%,结合形态和生理生化特征，SZW2被鉴定为肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae).

图3 PCR产物电泳图

图4 SZW2的16S rDNA系统发育树

3 讨论

碳酸盐矿化菌可用于建筑物和古迹裂缝的修复、沙土的加固、石质材料的保护和强化等领域[1-2]，也可用于土壤或地下水中重金属污染的修复和净化[7,13-14]，所以碳酸盐矿化菌的研究一直是国际上研究的热点，已报道的碳酸盐矿化菌主要有芽孢杆菌、硫酸盐还原菌、粘细菌、蓝细菌等，以芽孢杆菌为主，如嗜碱芽孢杆菌[15]、巴斯德芽孢杆菌[16]、巨大芽孢杆菌[17]、苏云金芽孢杆菌[18]、巴氏芽孢杆菌[19]等.本研究从绍兴周边建筑工地、房屋拆建以及重金属污染板结地等土壤样品中分离到5株高效沉积碳酸钙的菌株，其中2号菌(命名为SZW2)的碳酸钙沉积能力最强，经形态、生理生化和分子鉴定，SZW2为肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae).目前尚未见有关肺炎克雷伯菌沉积碳酸钙方面的报道，本研究丰富了碳酸盐矿化菌的菌种资源库，为该菌的进一步开发利用奠定了基础.