苏 倩 凌 琳 虞红珍 宋恩学

复发性流产是指连续发生2次及以上的自然流产，由于其病因、发生机制较为复杂，目前临床缺乏有效的治疗方法[1]。有关研究[2]发现，滋养细胞的增殖、绒毛血管新生在正常妊娠过程中发挥巨大作用。微小RNA(miR)是一种广泛存在于生物体内的短小RNA，具有高度保守性，能参与细胞增殖及凋亡、免疫反应、肿瘤发生、器官发育等相关生理、病理过程。miR-155是重要的miR类型,温海燕等[3]研究发现，复发性流产患者绒毛组织miR-155表达明显失调，易受低氧因素诱导，于新生血管调控中起关键作用。因此，本研究分析复发性流产患者绒毛组织miR-155表达情况，并分析其与子宫内膜氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及微血管密度(microvessel density, MVD)的关系，探究滋养细胞的增殖、绒毛血管新生与miR-155表达水平异常是否有关，为进一步研究复发性流产的发生机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年5月至2020年5月在安徽医科大学第二附属医院接受治疗的围植入期复发性流产患者80例纳入观察组，患者年龄23～39岁，平均(31.4±2.3)岁；胎龄53～66 d。观察组患者均符合《复发性流产诊治的专家共识》[4]中复发性流产的诊断标准；患者均无生殖道感染、染色体异常、内分泌系统疾病、生殖道结构异常、免疫系统疾病等情况。另同期选取80例正常早孕并要求终止妊娠妇女为对照组，患者年龄22～37岁，平均(31.2±2.5)岁；胎龄48～62 d。对照组所有对象经临床检查显示为正常宫内早孕，且宫内胚胎发育正常；无生殖道感染、染色体异常、内分泌系统疾病、解剖结构异常、免疫系统疾病及先兆流产等情况。两组对象的年龄、孕周、产次、胎数等基本资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 两组对象基本资料比较

1.2 方法 两组对象均经清宫术获取绒毛标本，Imag J分析条带灰度值，以β-actin作为内参，检测miR-155、HIF-1α、VEGF、MVD水平，通过Person相关分析miR-155表达与HIF-1α、VEGF及MVD的关系。

1.2.1 miR-155水平测定 采用RT-qPCR技术检测miR-155水平。TRlzol试剂盒购自美国Invirtogen公司，miR-155提取按照说明书进行，应用1%琼脂糖变性凝胶对RNA完整性进行电泳检测。操作步骤：将1 μg RNA逆转录为互补的DNA，即cDNA；选择RT的反应体系：1 μg的RNA在70℃环境下进行10 min预变性，4 μL的5×RT Buffer，1 μL的酶复合物，miR-155、内参照物U6逆转录引物混合1μmol，并将DEPC水加到20 μL，将未包含RT酶作为对照。设置RT反应条件是：16℃(30 min)、42℃(30 min)、94℃(15 min)；选择含对照物的RT产物1 μL作为模板，开展普通PCR，对特异性进行分析。选择反应体系：25 μL的1×Buffer，三磷酸脱氧核苷0.1 mmol，上游引物0.4 μmol，1 μL的下游引物0.25 μL的改造后相关耐热DNA聚合酶，将双蒸水加到25 μL。设置PCR的扩增条件是：2 min的94℃变性后，15 s的94℃，20 s的57℃，15 s的72℃，共开展35个循环。获取的PCR产物进行4%琼脂糖凝胶的电泳分析。选择总RNA(1μg)，经酶复合物的逆转录试剂盒进行cDNA合成后，将U6视作内参照，开展RT-qPCR检测。设置反应条件是：92℃(2 min)、94℃(15 s)、60℃(1 min)，共开展40个循环。对标准后的miR-155具体相对表达量进行准确计算，采用2-△Ct进行表示，△Ct为CtmiR-155、CtU6差值，其中Ct值是反应实时的荧光强度明显高于背景值时相关循环阈值。

1.2.2 HIF-1α、VEGF水平测定 采用免疫组化二步法[5]测定两组绒毛组织内HIF-1α、VEGF水平。将鼠抗人HIF-1α抗体及VEGF抗体、内皮细胞CD34的单克隆抗体(1∶150)视作一抗，选择免疫组化二步法进行染色，将磷酸盐缓冲液视作一抗阴性对照；对绒毛组织内HIF-1α、VEGF分布、含量进行观察，并用CD34对MVD进行标记。

1.2.3 MVD检测标准 以免疫组化的阳性反应程度表示表达量，阳性单位以PU表示，PU=[Ga-Gb]/Gmax100，其中Ga、Gb表示待测的结果、背景灰度值，而Gmax为256，是检测最大的灰度值；在每张切片上计数5个视野，将平均值视为此片MVD。

1.2.4 MVD判定标准 观察镜下视野显示棕黄色血管内皮细胞、细胞簇，且管腔是>8个红细胞构成，排除带有肌层血管[6]。

2 结果

2.1 两组对象绒毛组织内miR-155、HIF-1α、VEGF及MVD比较 观察组绒毛组织内miR-155、HIF-1α、VEGF表达及MVD分布均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。两组对象绒毛组织内HIF-1α、VEGF免疫组化染色(CD34)情况：对照组正常细胞可见棕色或棕褐色，观察组出现浅染色或不染色情况(图1)。观察组镜下MVD分布量显著少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

表2 两组对象绒毛组织内miR-155、HIF-1α、VEGF及MVD水平比较

注：A是对照组的绒毛组织内HIF-1α表达；B是观察组的绒毛组织内HIF-1α表达情况(不染色或浅染色)；C是对照组的绒毛组织内VEGF表达情况；D为观察组的绒毛组织内VEGF表达情况(不染色或浅染色)。

对照组

2.2 患者 miR-155表达量与HIF-1α、VEGF及MVD的关系 Person相关分析显示，患者绒毛组织内miR-155表达与HIF-1α、VEGF及MVD的相关系数r为0.544、0.574、0.642(P均<0.05)。见图3～5。

图3 患者miR-155表达量与HIF-1α相关性

图4 患者miR-155表达量与VEGF相关性

图5 患者miR-155表达量与MVD相关性

3 讨论

复发性流产作为常见妇产科病症，随着患者的流产次数增加，其再次流产风险亦不断升高；早期流产妇女中，复发性流产与染色体异常及生殖道生理异常因素、内分泌因素、免疫因素等多种因素有关，但部分病例仍难以明确病因，给针对性、有效性治疗造成一定难度[7]。目前，临床医学针对复发性流产多采用注射免疫球蛋白及抗凝血等相关免疫治疗为主，但少数患者治疗效果欠佳。

HIF-1α活性易受氧浓度的调节[8]，其可将100多种的低氧适应性基因表达激活，主要涉及人体的血管形成及重塑、糖酵解、相关细胞增殖与凋亡、红细胞生成等方面，在炎症、肿瘤相关血管生成、加快肿瘤增殖与转移、保持细胞能量代谢等方面发挥重要作用[9]。本研究结果显示，观察组患者的绒毛组织内miR-155表达量显著低于对照组，且miR-155表达与HIF-1α水平呈正相关(P<0.05)。从HIF-1α作为低氧应答相关全局性调控因子来看，HIF-1α于常氧条件下稳定性较差，能通过泛素-蛋白酶解的通路被快速降解，但缺氧能对其降解进行抑制，增加HIF-1α表达，并能经激活一系列的靶基因转录，促使细胞适应组织低氧、营养物质供应降低情况，对细胞生存、增殖进行维持[10]；正常早孕妇女的绒毛滋养细胞在低氧情况下刺激相关细胞因子、生长因子，增加HIF-1α表达并激活，对胎盘的血管生成具有重要的促进作用。

本组资料还显示，患者miR-155表达与VEGF、MVD水平呈正相关(P<0.05)，表明绒毛组织内miR-155表达异常可能与绒毛组织中新生血管存在密切联系，此与王玲等[11]的研究结果较为一致。分析原因：VEGF是人体内调节血管产生的重要中枢物质，对血管内皮细胞、滋养细胞相关分裂、迁移具有促进作用，能加快新生血管形成。杨桦等[12]在相关研究中发现，早孕情况下滋养细胞由于局部氧浓度减少，机体诱导HIF-1α高表达来上调VEGF相关因子表达，能促使绒毛组织耐受缺氧。在丁辉等[13]的研究中，滋养细胞释放的VEGF能作用在血管内皮细胞，与胎盘的血管新生、胎盘血管通透性具有密切联系，血清中VEGF含量与子宫内膜异位症病理分期存在明显相关性，可辅助支持本研究结果。此外，滋养细胞的表型转换、胎盘相关血管发育障碍易引起血管机能不全，减少血管数目，进而造成MVD下降，且绒毛的螺旋动脉、滋养层相关侵袭表浅，导致胎盘的灌注减少，引起母儿循环障碍而出现自然流产[14-15]。由于本研究只对miR-155表达与HIF-1α、VEGF、MVD进行了相关性分析，未进一步探究miR-155对以上指标的影响途径和作用机制，尚不能明确发现miR-155对复发性流产的具体影响程度，有待今后进一步研究。

综上所述，围植入期复发性流产妇女子宫内膜的miR-155、HIF-1α、VEGF表达水平及MVD水平均低于正常早孕妇女，且绒毛组织miR-155与滋养细胞的增殖、新生血管异常具有密切联系。miR-155在多种的病理及生理过程中均有一定参与作用，其表达过度对细胞增殖、MVD具有重要影响作用。