郭永宏, 杨艳峰, 高 放, 陈婷婷, 卢亚亨, 陈 莉

(电子科技大学医学院成都市妇女儿童中心医院 儿童心脏内科, 四川 成都, 610073)

川崎病是临床较常见的一类自身免疫性疾病, 病理特征以全身弥漫性血管炎为主，主要损伤冠状动脉[1]。研究[2]表明，川崎病伴冠状动脉损伤的成人和儿童患者外周循环静脉血中同型半胱氨酸(Hcy)水平显著高于川崎病不伴冠状动脉损伤患者或健康对照者。Hcy水平升高可上调血管黏附细胞分子-1、单核细胞趋化蛋白-1、白细胞介素(IL)-8和IL-6等的表达，广泛参与血管炎症反应[3]。Hcy水平升高已被证实是动脉粥样硬化性心血管疾病的独立预测因子[4], 故推测Hcy可能参与川崎病继发冠状动脉损伤的发生。心血管疾病患者血清组织蛋白酶水平与炎症因子表达水平呈正相关[5], 组织蛋白酶V(CTSV)是组织蛋白酶家族成员之一，能够促进内皮细胞释放多种炎症因子，诱导病灶部位的炎症反应紊乱[6]。活化的蛋白激酶C(PKC)可激活下游的属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的ERK、p38、JNK信号通路，实现细胞内信号传递[7]。激活的MAPK在细胞生长、增殖、分化、凋亡等多种生理、病理功能的调控中发挥着重要作用[8]。信号转导及转录激活因子1(STAT1)位于多条信号通路的终末阶段，是调控细胞内信号通路活化强度的枢纽分子，也是MAPK通路下游的关键点[9]。本研究分析体外不同浓度Hcy介导PKC/MAPK/STAT1信号通路对人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)中CTSV和炎症因子表达的影响机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源和培养

HCAECs购自上海弘顺生物有限公司，在含10%胎牛血清的完全培养基中贴壁培养，待细胞铺满培养瓶底面80%以后，胰蛋白酶消化细胞终止培养，然后以1∶3比例传代培养。选择对数生长期细胞用磷酸盐缓冲液重悬细胞浓度为1×106/L, 进行分组实验。

1.2 主要试剂和仪器

Hcy冻干粉试剂购自美国Sigma公司，纯度大于85%; 完全培养基购自美国R&D公司，四氮唑蓝盐化合物(MTS)试剂盒购自江苏碧云天科技有限公司，蛋白裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司，鼠抗人PKC/MAPK/STAT1、CTSV和GAPDH抗体一抗购自美国Sigma公司，对应兔抗鼠抗体二抗购自美国Sigma公司，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国Invitrogen 公司。96孔培养板购自美国Applied Biosystems公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，蛋白电泳仪购自美国Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组: 实验分为4组，即对照组(空白对照)、低浓度组(Hcy 1 mmol/L)、中浓度组(Hcy 5 mmol/L)和高浓度组(Hcy 10 mmol/L)组。对照组用等体积生理盐水，另3组用Hcy冻干粉与生理盐水混合配成不同浓度溶液，分别与HCAECs在含10%胎牛血清的完全培养基, 37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中共培养72 h。每组设置6个复孔，结果取平均值。

1.3.2 MTS法检测细胞活力: 将各组HCAECs接种于96孔培养板中共培养72 h后，根据MTS试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上测定490 nm波长处的光密度(OD)值代表细胞活力。

1.3.3 蛋白质印迹法(Western blot)检测PKC、MAPK、STAT1和CTSV表达量: 各组HCAECs培养72 h后加入细胞裂解液，充分震荡后提取细胞中总蛋白分子，根据蛋白定量试剂盒提示检测蛋白浓度和纯度，符合要求后采用内参GAPDH进行剂量标准化。取30 μg样本总蛋白和等量标准蛋白，经8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，将分离区带电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜; 依次加入鼠抗人PKC/MAPK/STAT1、CTSV和GAPDH抗体一抗(工作浓度为1∶2 000)静置过夜，洗涤后加入兔抗鼠多克隆抗体二抗(工作浓度为1∶500)室温下孵育4 h, 洗涤后加入ECL显色剂。结果扫描保存，采用Lab Works 4.5凝胶成像软件(美国Invitrogen公司)行半定量分析，结果以目标蛋白与内参蛋白的电泳条带灰度值的比值表示。

1.3.4 ELISA法检测炎症因子水平: 各组HCAECs培养72 h后以2 500×g离心10 min, 取上清液，根据对应试剂ELISA试剂盒提示进行检测，绘制浓度曲线。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 细胞活力比较

中浓度组、高浓度组细胞活力高于对照组、低浓度组，高浓度组细胞活力高于中浓度组，差异有统计学意义(P<0.05), 对照组与低浓度组细胞活力比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表1。

表1 各组细胞活力比较

2.2 PKC、MAPK、STAT1和CTSV表达量比较

中浓度组、高浓度组PKC、MAPK、STAT1、CTSV相对表达量高于对照组、低浓度组，且高浓度组高于中浓度组，差异有统计学意义(P<0.05); 对照组PKC、MAPK、STAT1、CTSV相对表达量与低浓度组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表2。

表2 各组PKC、MAPK、STAT1和CTSV相对表达量比较

2.3 炎症因子表达水平比较

中浓度组、高浓度组VEGFR-1、TNF-α、IL-1β表达水平高于对照组、低浓度组，且高浓度组高于中浓度组，差异有统计学意义(P<0.05); 对照组炎症因子表达水平与低浓度组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组炎症因子表达水平比较 mmol/L

3 讨 论

杨蕊华等[10]报道，川崎病患儿血清Hcy、C反应蛋白和纤维蛋白原水平与冠状动脉损伤密切相关。虽然川崎病的发病机制尚未完全阐明，但临床已确认机体的炎症和免疫功能紊乱与川崎病的发生密不可分[11]。冠状动脉是川崎病的重要损伤部位，以内皮细胞功能障碍为主，释放和诱导大量炎症介质与炎症细胞聚集[12]。既往研究[13-14]证实，高Hcy血症是心脑血管疾病的主要危险因素之一，且与冠状动脉损伤程度一致，其主要机制是影响糖脂和氨基酸代谢，导致内皮细胞功能障碍，诱导形成粥样硬化性斑块[15]。但川崎病继发冠状动脉损伤以炎症为主，缺少导致管腔狭窄的粥样斑块，故尚不清楚Hcy是否在其中扮演重要角色。本研究假设Hcy可诱导川崎病继发冠状动脉损伤，采用体外细胞实验方法探讨不同浓度Hcy在川崎病中的作用机制。

本研究发现，中浓度组、高浓度组细胞活力高于对照组、低浓度组，高浓度组高于中浓度组，差异有统计学意义(P<0.05), 而对照组与低浓度组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05), 提示高浓度Hcy可激活HCAECs, HCAECs活力增高表示细胞损伤风险加大。DEHARO P等[16]指出, Hcy与冠心病患者血浆腺苷A2A受体(A2AR)的产生及细胞中A2AR和环磷酸腺苷的产生呈负相关，而A2AR的产生和功能降低会阻碍冠状动脉血流并促进炎症，这可能支持冠状动脉损伤性疾病的发病。进一步发现，中浓度组、高浓度组PKC、MAPK、STAT1和CTSV相对表达量高于对照组、低浓度组，且高浓度组高于中浓度组，差异有统计学意义(P<0.05), 对照组与低浓度组差异无统计学意义(P>0.05), 提示高浓度Hcy可激活PKC/MAPK/STAT1信号通路和诱导CTSV蛋白表达，参与冠状动脉的损伤。组织蛋白酶 C在冠状动脉组织中的表达上调可能促进TNF-α表达，从而影响冠心病的发生和发展[17], 但CTSV与冠状动脉损伤发生的关系还不明确。CTSV的主要功能是水解多种蛋白酶，主要在中性粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞等溶酶体中表达，生理功能是激活促炎性颗粒相关的丝氨酸蛋白酶，从而促进炎症反应[18]。齐双辉等[19]指出，人参皂苷Rb1能够激活蛋白酪氨酸激酶2/STAT3信号通路，进而减轻川崎病小鼠的心肌损伤。LI S M等[20]研究发现，川崎病患儿血清和HCAECs中有148个蛋白的磷酸化程度不同，富含MAPK、VEGFR、表皮生长因子受体(EGFR)、血管生成素受体等。

本研究结果显示，中浓度组、高浓度组VEGFR-1、TNF-α、IL-1β水平高于对照组、低浓度组，且高浓度组高于中浓度组，差异有统计学意义(P<0.05), 对照组与低浓度组差异无统计学意义(P>0.05), 提示高浓度Hcy能够诱导更多的炎症因子表达，参与冠状动脉的损伤。顾勇等[21]指出，miRNA-145可能通过调节VEGF的表达参与川崎病的发病，且与冠脉损伤的发生相关。血管内皮生长因子(VEGF)与VEGFR-1特异性结合，在诱导内皮细胞功能障碍中发挥重要作用[22]。TNF-α和IL-1β是主要的促炎介质，也是诱导瀑布样炎症级联反应的核心分子，能够诱导更多的炎症细胞和炎症介质释放[23-24]。

综上所述, Hcy浓度升高可激活HCAECs中PKC/MAPK/STAT1信号通路影响CTSV和炎症因子的表达，且呈浓度依赖性。Hcy表达升高与冠状动脉损伤性疾病密切相关，故Hcy有望成为临床干预川崎病伴冠状动脉损伤的重要靶点。未来可通过人体临床研究和动物模型探讨Hcy在川崎病伴冠状动脉损伤患者和动物模型中的表达，以及Hcy与PKC/MAPK/STAT1信号通路、CTSV、炎症因子之间的关系，为临床靶向干预提供强有力的理论依据。