刘 峥，易秋艳，刘 阳（通信作者）

（1四川省药品技术检查中心<四川省疫苗检查中心>药品生产检查组 四川 成都 610031）

（2四川省药品检验研究院<四川省医疗器械检测中心>微生物室 四川 成都 610000）

利巴韦林滴眼液适用于单纯疱疹病毒性角膜炎，利巴韦林为抗非逆转录病毒药，不具有充分的抗菌作用，在生产过程中添加适量的抑菌剂可防止污染微生物而变质。配方选择抑菌剂时应综合考察其稳定性、安全性、配伍可行性、抑菌效果等多方面的因素[1-3]。苯扎溴铵是滴眼剂生产中常用的抑菌剂。2020年版《中国药典》[4]规定“抑菌剂的抑菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而变化，因此，应验证成品制剂的抑菌效力在效期内不因贮藏条件而降低。”本文对市售两批含苯扎溴铵0.2%（V/V）的利巴韦林滴眼剂分别人工污染5种标准菌株，计算培养不同时间后存活菌数的常用对数值相对于初始值减少的量来测试滴眼剂对相应菌株的抑菌效力。

1.资料与设备

1.1 一般资料

利巴韦林滴眼液，批号：200417，规格：8 mL:8 mg，生产单位：安徽环球药业股份有限公司。

利巴韦林滴眼液，批号：20190124，规格：8 mL:8 mg，生产单位：长春长庆药业集团有限公司。

两批滴眼液中抑菌剂苯扎溴铵的含量均为0.2%（V/V）。

1.2 试剂试药

胰酪大豆胨琼脂培养基，以下简称TSA（批号190704）、沙氏葡萄糖琼脂培养基，以下简称SDA（批号200310）、胰酪大豆胨液体培养基（批号200310）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号180228）、pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号181026）均由北京三药科技开发公司提供。培养基适用性检查试验结果均符合《中国药典》[4]要求。

1.3 试验菌株

金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus[CMCC（B）26 003]第3代；表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis [CMCC（B）26 069]第3代；铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC（B）10 104]第3代；白色念珠菌Candida albicans[CMCC（F）98 001]第3代；黑曲霉Aspergillus niger[CMCC（F）98 003]第3代。来源均为中国食品药品检定研究院购买的0代冻干菌，自行传代培养至所需代数。

1.4 设备

Thermo Class A Ⅱ生物安全柜、BINDER BD 720生物培养箱、BINDER KB 400生物培养箱、三鑫YXQ-WF32D压力蒸汽灭菌锅、IKA涡旋混合仪基本型MS3。

2.方法

2.1 存活菌数测定方法的确定

为准确测定供试品中加入试验菌的存活菌数，应进行存活菌数测定方法适用性试验。取200417批及20190124批滴眼液按《中国药典》[4]通则1105试验，回收率不得低于50%。

2.1.1 试验过程 实验共设四个组 试验组、菌液对照组、供试品对照组和阴性对照组。

试验组：细菌计数取原液、1:10、1:20、1:50供试液10 mL分别加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌三种试验菌的菌悬液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混匀后，分别取1 mL置直径90 mm无菌平皿中，并注入15～20 mL温度不超过45 ℃的胰酪大豆胨琼脂混匀，待琼脂凝固后，倒置放入33 ℃培养箱培养48 h后计数（细菌计数用金黄色葡萄球菌进行预试验）。

真菌计数取供试品原液、1:10供试液10 mL分别加入白色念珠菌、黑曲霉两种试验菌的菌悬液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混匀后，分别取1 mL置直径90 mm无菌平皿中，并注入15～20 mL温度不超过45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基混匀，待琼脂凝固后，倒置放入25 ℃培养箱培养72 h后计数。

菌液对照组：取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 mL分别加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌三种试验菌的菌悬液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混匀后，分别取1 mL置直径90 mm无菌平皿中，并注入15～20 mL温度不超过45 ℃的胰酪大豆胨琼脂混匀，待琼脂凝固后，倒置放入33 ℃培养箱培养48 h后计数。取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 mL分别加入白色念珠菌、黑曲霉两种试验菌的菌悬液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混匀后，分别取1 mL置直径90 mm无菌平皿中，并注入15～20 mL温度不超过45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基混匀，待琼脂凝固后，倒置放入25 ℃培养箱培养72 h后计数。五种试验菌均平行制备2个平皿。

供试品对照组：细菌计数取原液、1:10、1:20、1:50供试液10 mL加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.1 mL，充分混匀后，分别取1 mL置两个直径90 mm无菌平皿中，并注入15～20 mL温度不超过45 ℃的胰酪大豆胨琼脂混匀，待琼脂凝固后，倒置放入33 ℃培养箱培养48 h后计数。真菌计数取供试品原液10 mL、1:10供试液加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.1 mL，充分混匀后，分别取1 mL置两个直径90 mm无菌平皿中，并注入15～20 mL温度不超过45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基混匀，待琼脂凝固后，倒置放入25 ℃培养箱培养72 h后计数。

阴性对照组：细菌计数取1 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液置直径90 mm无菌平皿中，并注入15～20 mL温度不超过45 ℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，倒置并按规定条件培养、计数。真菌计数取1mlpH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液置直径90 mm无菌平皿中，并注入15～20 mL温度不超过45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置并按规定条件培养、计数。

2.1.2 试验结果 两批样品按《中国药典》[4]方法试验，结果见表1、2。取原液、1:10、1:20供试液分别加金黄色葡萄球菌试验，回收率均小于50%，上述稀释级供试液均不适用于细菌计数；取原液加白色念珠菌、黑曲霉试验，回收率均小于50%，原液不适用于真菌计数。另取1:50供试液加金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌试验，回收率均大于50%；另取1:10供试液加白色念珠菌、黑曲霉试验，回收率均大于50%。

表1 200417批菌落计数测定结果

计算公式：试验组菌回收率=［（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）÷菌液对照组菌落数］×100%。

表2 20190124批菌落计数测定结果

根据以上结果，存活菌数测定方法可确定为：按倾注法，取1:50供试液进行细菌数的测定；取1:10供试液进行真菌数的测定。两批滴眼剂按此方法试验，5种标准菌的回收率均大于50%，方法成立。

2.2 抑菌效力测定方法

2.2.1 菌悬液的制备及浓度 取经33 ℃培养24 h的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌的胰酪大豆胨琼脂平板，分别用一次性接种环刮取适量菌体至0.9%无菌氯化钠溶液稀释并制成每1 mL含菌数约为108～109cfu的菌悬液。用倾注法测得菌悬液的浓度分别为4.2×109、2.2×109、8.4×108cfu/mL。取经25 ℃培养48 h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂平板，用一次性接种环刮取适量菌体至0.9%无菌氯化钠溶液稀释并制成每1 mL含菌数约为107cfu的菌悬液。用倾注法测得菌悬液的浓度为9.4×107cfu/mL。经25 ℃培养7 d的黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后用无菌吸管将孢子悬液吸出至无菌试管内，加入适量的含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数约为107cfu的孢子悬液。用倾注法测得浓度为8.0×106cfu/mL。

2.2.2 供试品接种 按《中国药典》[4]中<1121抑菌效力检查法>规定，采取原位接种的方式，将试验菌直接接种于供试品容器中进行试验，菌液的体积不超过供试品体积的1%。每批样品取10支（8 mL/支）分别接种2.2.1的5种菌液（1×107～1×108cfu/mL）各80 μl，每种试验菌各接种2支，涡旋混匀，25 ℃避光放置。

3.结果

3.1 存活菌数测定结果

分别在6 h、24 h、7 d、14 d、28 d取接种后25 ℃放置的滴眼剂按2.1确定的计数方法测定样品中的存活菌数，以菌数变化情况评价其抑菌效力。计算每一种试验菌在供试品中的存活菌数，并换算成lg值，与供试品中0 h接种菌数的lg值或前一测定时间点存活菌数的lg值比较，计算经过不同放置时间后的对数下降值，结果见表3、4。两批样品细菌组在接种6 h后活菌数减少的lg值均大于2，24 h后减少的lg值均大于3，至28 d均未恢复生长；真菌组供试品在接种7 d后活菌数减少的lg值均大于2，至28 d均无增加趋势。

表3 200417批接种后不同时间存活菌数cfu/mL及相对0 h减少值（lg）

表4 20190124批接种后不同时间存活菌数及减少值cfu/mL（lg）

4.讨论

4.1 实验菌株的选择

按《中国药典》[4]要求，测试滴眼剂的抑菌效力应选择的标准菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌及黑曲霉四种。考虑到在临床上的检出率，增加了表皮葡萄球菌[5]，故本试验共五种标准菌株。

4.2 结果判断

两批含苯扎溴铵0.2%（V/V）的利巴韦林滴眼液（批号：200417，20190124）参照《中国药典》[4]，分别人工污染5种标准菌株：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，测试在特定时间内供试品对相应菌株的抑制效力，结果试验的两批利巴韦林滴眼液抑菌效力均能达到《中国药典》[4]滴眼剂A级标准，符合在有效期内长期储存的要求，见表5。

表5 滴眼液抑菌效力判断