龙杰凤，胡秀虹，范成念，杨违仙

(凯里学院大健康学院，贵州 凯里 556011)

0 引言

黄精(Polygonatumsibiricum)属百合科多年生草本植物，别名鸡头黄精、老虎姜。黄精作为传统的滋补类中药，被广泛应用于中医临床，2020年版《中国药典》收载的三种黄精为黄精、滇黄精、多花黄精的干燥根茎，且药典规定的黄精炮制方法为“置沸水中略烫或蒸至透心，干燥”[1]；而在贵州苗族地区喜用鲜黄精治疗胃肠炎、皮肤癣等病症，具有一定的疗效。大量学者的研究多集中在制黄精的成分分析及抗氧化活性上，对生黄精的药用研究甚少，且对生黄精多糖抑菌活性研究未见报道[2-4]。本文通过提取生黄精多糖，探究生黄精多糖对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌五种致病菌的抑菌作用，为开发苗药具有一定的推进作用，为生黄精相关产品的开发利用提供数据参考。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材的购买与处理

生黄精来源于笔者参加全国第四次中药资源普查中在贵州省镇远县、黄平县、印江县、梵净山等多个地区采集而得，将生黄精药材清洗干净，新鲜切片，捣碎，密封存放于2～8 ℃冰箱中备用。

1.1.2 实验菌株

由凯里学院民族药工程中心提供的五种菌：白色念珠菌(CandidaAlbicans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereu)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(BacillusmegateriumdeBary)。

1.1.3 实验设备与试剂

超声仪SK8200HP(上海科导超声仪器有限公司)、立式压力蒸汽灭菌器BXM-30R(上海博讯实业有限公司)、生化培养箱BSP-150(上海博讯实业有限公司)、消毒柜ZTP-78L-A01(佛山市六百年电器)、净化工作台(上海博讯实业有限公司)、数显水浴恒温振荡器、抑菌圈(抗生素效价)测量仪；无水乙醇、石油醚、α-萘酚，均为试剂纯，购于重庆川东化工。

1.1.4 供试培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨20 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、琼脂15 g，蒸馏水1000 mL；沙氏培养基：琼脂20 g、蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、蒸馏水1000 mL。

1.2 实验方法

1.2.1 药材的预处理(石油醚脱脂)

分别称取3份50 g生黄精碎末，加入3个三角瓶中，再向三角瓶中加入适量石油醚进行脱脂[6](没过药材约2～3 cm)。将3个三角瓶用铁架台固定于超声波清洗器中，设置时间为30 min、功率90%、工作频率为53 kHz，开启超声。石油醚脱脂结束后，倾出提取液，弃液留渣，自然状态下，挥干剩余的石油醚，作为提取的原料。

1.2.2 超声波辅助提取多花黄精

按照料液比1∶15，向已脱脂处理的3个三角瓶中分别加入已灭菌好的蒸馏水，将三角瓶用铁架台固定于超声波清洗器中，设置提取时间40 min，超声波作用功率90%，工作频率53 kHz，提取结束后，用脱脂棉过滤2次，再用滤纸过滤1次，将滤液转移至3个三角瓶中，将提取液用电磁炉水浴加热浓缩到50 mL，得到浓缩液的浓度为0.5 g/mL。用保鲜膜将瓶口封好，冷却至室温或者更低温度后，放入冰箱5 ℃保存备用[5-6]。

1.2.3 菌种活化

在无菌操作条件下[7]，用接种环刮取金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉酶芽孢杆菌的菌落在制备好牛肉膏蛋白胨培养基的固体培养基上划线培养，放入生化培养箱(BSP-150)中37 ℃下，倒置培养24 h。白色念珠菌则在制备好的沙氏固体培养基上划线培养，放入霉菌培养箱(BMJ-160)中28 ℃下，培养24 h，即得到活化后的供试菌种。

1.2.4 菌液制备

将活化的菌种用接种环刮取菌落接到25 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基(若接白色念珠菌则用沙氏液体培养基)中，放入水浴恒温振荡器(SPCC-SHA-C)中37 ℃摇床培养22 h，即得到菌液[8]。在净化工作台(SW-CJ-1FD)中，开启紫外30 min，风机10 min，用无菌注射器分别吸取9.9 mL已灭菌的0.9%生理盐水加入到5支已灭菌的试管中，再用移液枪吸取100 μL经水浴恒温振荡培养好的菌液，加入试管中稀释成实验所需要的菌悬液。

1.2.5 体外抑菌试验

按照滤纸片法进行试验操作[8]：分别用移液枪吸取 0.2 mL各菌悬液，加到牛肉膏蛋白胨固体培养基表面上并涂布均匀。将生黄精多糖用对倍稀释法，分别配制成浓度为0.5 g/mL、0.25 g/mL、0.125 g/mL、0.0625 g/mL、0.03125 g/mL的抑菌药液，用移液枪各吸取5 mL上述浓度的药液(对照则用无菌水代替药液，其他条件不变)分别放入已灭菌好的培养皿中，然后将已灭菌并烘干的滤纸片(直径6 mm)放入培养皿中进行浸泡，每个培养皿放25片，浸泡2 h后，用镊子取出后等待微干，放入培养皿中，每个培养皿等距离放置不同浓度抑菌液浸泡过的滤纸片，每个菌种做3个平行。然后倒置于生化培养箱(BSP-150)中培养，37 ℃下培养 24 h(白色念珠菌则放入霉菌培养箱(BMJ-160)中培养，27 ℃下培养24 h)，观察并记录结果，取出培养皿后，用讯数-抑菌圈(抗生素效价)测量仪(CzoneG67)对培养基进行图像的拍摄，并标定抑菌圈，进行抑菌圈直径的大小的测量，比较抑菌效果。

2 实验结果及数据分析

2.1 抑菌活性测定

通过纸片法，将不同浓度的黔产生黄精多糖对5种供试菌株进行抑制试验，采用讯数-抑菌圈(抗生素效价)测量仪(CzoneG67)对抑菌圈直径进行测量。综上分析，结果见表1-表6。

表1 黔产生黄精多糖对白色念珠菌抑菌圈的测定Tab.1 Determination of inhibition zone of polysaccharideinPolygonatum sibiricum on Candida albicans

表2 黔产生黄精多糖对金黄色葡萄球菌抑菌圈的测定Tab.2 Determination of inhibition zone of polysaccharide inPolygonatum sibiricum on Staphylococcus aureus

实验结果表明，黔产多花黄精药液浓度在31.25～500 mg/mL范围内，对5种供试菌种均具有抑菌效果，抑菌圈直径大小为：巨大芽孢杆菌>解淀粉芽孢杆菌>蜡样芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>白色念珠菌。其中，在药液浓度为125 mg/mL时，对巨大芽孢杆菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直径为12.826 mm。

表3 黔产生黄精多糖对蜡样芽孢杆菌抑菌圈的测定Tab.3 Determination of inhibition zone of polysaccharide inPolygonatum sibiricum on Bacillus cereus

表4 黔产生黄精多糖对巨大芽孢杆菌抑菌圈的测定Tab.4 Determination of inhibition zone of polysaccharidein Polygonatum sibiricum on Bacillus megaterium

表5 黔产生黄精多糖对解淀粉芽孢杆菌抑菌圈的测定Tab.5 Determination of inhibition zone of polysaccharide inPolygonatum sibiricum on Bacillus amyloliquefaciens

表6 黔产生黄精多糖对5种菌株抑菌圈平均直径表Tab.6 Average diameter of inhibition zone of polysaccharide inPolygonatum sibiricum on the five kinds of bacteria

2.2 稳定性实验(方差分析)

用SPSS24.0对药液浓度与抑菌圈直径大小的关系进行单因素方差分析，所得结果如表7至表11所示，分别为白色念珠菌抑菌圈直径方差分析、解淀粉芽孢杆菌抑菌圈直径方差分析、金黄色葡萄球菌抑菌圈直径方差分析、巨大芽孢杆菌抑菌圈直径方差分析、蜡样芽孢杆菌抑菌圈直径方差分析，通过数据可知，黔产多花黄精对5种实验菌的抑菌圈直径方差显著性P<0.05，具有统计学意义，即黔产生黄精多糖对白色念珠菌、解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌这5种菌的生长，均具有良好的抑制效果。

表7 白色念珠菌抑菌圈直径方差分析表Tab.7 Variance analysisof inhibition zone diameter onCandida albicans

表8 解淀粉芽孢杆菌抑菌圈直径方差分析表Tab.8 Variance analysis of inhibition zone diameter onBacillus amyloliquefaciens

表9 金黄色葡萄球菌抑菌圈直径方差分析表Tab.9 Variance analysis of inhibition zone diameter onStaphylococcus aureus

表10 巨大芽孢杆菌抑菌圈直径方差分析表Tab.10 Variance analysis of inhibition zone diameter onBacillus megaterium

表11 蜡样芽孢杆菌抑菌圈直径方差分析表Tab.11 Variance analysis of inhibition zone diameter onBacillus cereus

2.3 抑菌剂活性测定

由图1可知，黔产生黄精多糖对这5种供试菌株均具有良好的抑菌效果。其中对巨大芽孢杆菌的抑菌效果最为明显，当药液浓度为125 mg/mL时抑菌效果最好，作用最优；对白色念珠菌抑菌作用最弱。

图1 不同药物浓度对5种菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different concentrationsof polysaccharide on the five kinds of bacteria

3 结论与讨论

1)实验研究结果表明，黔产生黄精多糖对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌这5种试验菌株均具有良好的抑菌活性。其中，对白色念珠菌的最佳抑菌浓度为62.5 mg/mL，对其他4个供试菌株的最佳抑菌浓度都为125 mg/mL。对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的最大平均抑菌圈直径分别为9.460 mm、10.302 mm、10.367 mm、10.828 mm、12.826 mm，由此可见，黔产生黄精多糖对巨大芽孢杆菌的抑菌效果最优，最适浓度为125 mg/mL。

2)生黄精多糖具有广谱抗菌性，本实验的研究结果将为生鲜黄精进一步开发成天然抑菌剂提供理论基础和数据参考[10]。