李 静，任其龙，潘远江

(1.浙江大学化学工程与生物工程学院，生物质化工教育部重点实验室，浙江 杭州 310027；2.浙江大学衢州研究院，浙江 衢州 324000； 3.浙江大学化学系，浙江 杭州 310027)

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)具有灵敏度高、检测限低、盐类容忍度高、制样简便等优势[1]，广泛应用于蛋白质、DNA、磷脂、聚合物、药物及其代谢物等多种类型化合物的分析中[2-4]。基质在MALDI-TOF MS分析过程中发挥着至关重要的作用，其吸收激光能量气化后将样品分子带入气相，并将能量和质子转移给样品分子，使样品分子离子化。随着MALDI应用的增加，基质的发展和选择在优化该技术方面尤其重要[5-6]。MALDI基质通常是具有低蒸汽压的弱有机酸，其中α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)是应用最广泛的基质之一，其结构简单，质子化后的质谱信息不会对待测物的解析产生干扰，可以用于检测多种化合物。但是，在有些情况下，基质与待测物发生反应，生成的新物质给待测物的检测和解析造成困扰[7-10]。因此，MALDI基质与待测物之间的反应研究是非常重要的。

电喷雾电离质谱(ESI-MS)具有溶剂适用性广、电离效率高、所需样品量少、质量范围宽等特点，是生物大分子分析领域不可或缺的工具[11]。通常，一级质谱只能得到生物样本的分子质量信息，无法获得结构信息，可通过串联质谱技术获取。碰撞诱导裂解(CID)技术通过引入碰撞气体至碰撞室与母离子碰撞，使母离子裂解产生碎片，从而获得结构信息[12]。ESI-MS与CID技术的结合不仅可以分析大量不同种类的化合物，而且在有机和生物化合物的结构解析方面发挥着不可替代的作用。

半胱氨酸侧链上的巯基是构成蛋白质的氨基酸残基中最活泼的基团，以自由的—SH、离子化的硫醇或氧化的—S—S—形式存在[13]。这使得半胱氨酸成为最活泼的天然氨基酸，是肽和蛋白质发挥功能的关键单元。半胱氨酸具有固定细胞色素中血红素的功能，参与一系列翻译后修饰、形成二硫键，在很多金属蛋白中可以起到结合金属离子、抗氧化等作用[14-15]。由于参与多种生理过程，半胱氨酸及其残基一直是生物和生物化学领域重要的研究对象。

本工作拟以含有巯基的氨基酸、肽、蛋白质作为研究对象，采用MALDI-TOF MS中常用基质HCCA与研究对象发生反应。通过ESI-MS结合CID技术分析HCCA与含巯基的氨基酸、肽及蛋白质反应产物的结构，并研究此类化合物产生的加成反应机理。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

LCQ质谱仪：美国Thermo Fisher公司产品，配有电喷雾离子源；AutoflexⅢ基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(配有基质辅助激光解吸离子源)、microTOF QII(Q-TOF)高分辨质谱仪(配有电喷雾离子源)：德国布鲁克仪器有限公司产品；Milli-Q超纯水纯化系统：美国Millipore公司产品。

1.2 材料与试剂

本研究所用分析物和MALDI基质的结构式示于图1。猪胰岛素(A3)：美国Sigma公司产品；半胱氨酸、α-氰基-4-甲氧基肉桂酸(M)、五肽RCDAA(A1)、五肽RCEAA(A2)、二硫苏糖醇(DTT)：北京百灵威科技有限公司产品；α-氰基-4-羟基肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、反式-3-吲哚酸(IAA)、芥子酸(SA)：德国Bruker Daltonics公司产品；甲醇(色谱纯)：德国Merck公司产品；实验用水：由Milli-Q纯水系统制备。

图1 基质以及分析物的结构和分析物序列Fig.1 Structures of the matrices and HCCA derivatives, and amino acid sequence of analytes

1.3 实验条件

1.3.1MALDI基质与分析物反应条件 半胱氨酸、A1、A2、A3与MALDI基质DHB、IAA、SA、HCCA及HCCA衍生物M的孵化条件：酸性(pH 3.0)、弱酸性(pH 6.0)、碱性(pH 9.0)；分析物与基质的反应摩尔比为1∶500；A3二硫键还原试剂为二硫苏糖醇(DTT)；分析物与基质反应温度为室温。

1.3.2质谱条件 LCQ质谱仪：电喷雾离子源，正、负离子模式采样；检测电压4.5 kV；氮气压力2.5 MPa；样品流速5 μL/min；离子传输管温度250 ℃；碰撞气体为高纯氩气；二级质谱碰撞能量20%；一级质谱质量采集范围m/z100～1 000；二级质谱质量采集范围m/z100～1 000；数据采集处理：取50次扫描平均值。

MALDI-TOF MS质谱仪：基质辅助激光解吸离子源，正离子模式采样；氮激光波长355 nm；进样靶板SCOUT MTP 96；激光能量范围30%～70%；激光累计次数1 500；离子加速电压1 kV；一级质谱质量采集范围m/z100～8 000；采用BSA胰蛋白酶酶切产物进行质量矫正。

Q-TOF高分辨质谱仪：电喷雾离子源，正离子模式采样；样品流速180 μL/h；进样泵进样；氮气流速4 L/min，氮气流速压力0.4×105Pa；离子源温度180 ℃；检测电压3.5 kV；采用三氟乙酸钠聚合物进行高分辨质量矫正。

2 结果与讨论

2.1 MALDI-TOF MS结果分析

2.1.1半胱氨酸与基质加合物的鉴定 选择半胱氨酸(C)作为模型化合物，研究其与MALDI基质的加成反应。基质HCCA的MALDI-TOF质谱图示于图2a，离子峰m/z172.1、190.2、212.2、379.4 和568.2分别为[HCCA-H2O+H]+、[HCCA+H]+、[HCCA+Na]+、[2HCCA+H]+、[3HCCA+H]+。在酸性条件(pH 3.0)下，HCCA与半胱氨酸反应产物的质谱图示于图2b，基峰m/z122.3为准分子离子峰[C+H]+，半胱氨酸与HCCA加成产物的准分子离子峰m/z311.2为[C+HCCA+H]+，相对强度较弱。在弱酸性条件(pH 6.0)下，半胱氨酸与HCCA加成产物的准分子离子峰m/z311.4[C+HCCA+H]+相对强度明显增强，示于图2c。在碱性条件(pH 9.0)下，加成产物的准分子离子峰m/z311.1[C+HCCA+H]+相对强度最大，成为图2d中的基峰。以上结果表明，半胱氨酸与HCCA的加成反应受pH值的影响，碱性条件下此反应最完全。HCCA基质适合半胱氨酸的检测，但二者反应产物的离子峰对质谱图的解析造成干扰。

注：a.50%乙腈；b.pH 3.0;c.pH 6.0;d.pH 9.0图2 HCCA(a)和HCCA-C加合物(b,c,d)的MALDI-TOF 质谱图Fig.2 MALDI-TOF mass spectra of the HCCA (a) and HCCA-cysteine adducts (b, c, d)

本研究同时考察了半胱氨酸与MALDI其他常用基质DHB、SA、IAA的反应，分别示于图3～5。在图3a中，m/z137.3、155.1、177.3、193.4和273.1分别为[DHB-H2O+H]+、[DHB+H]+、[DHB+Na]+、[DHB+K]+和[2DHB-2H2O+H]+。半胱氨酸与DHB在酸性、弱酸性和碱性条件下反应所得的质谱图分别示于图3b～3d，图中基峰均为[C+H]+m/z122.2，没有观察到[C+DHB+H]+的出现。

注：a.50%乙腈；b.pH 3.0；c.pH 6.0；d.pH 9.0图3 DHB(a)和DHB-C加合物(b,c,d)的MALDI-TOF质谱图Fig.3 MALDI-TOF mass spectra of the DHB (a) and DHB-cysteine adducts (b, c, d)

基质SA的MALDI-TOF质谱图示于图4a，其与半胱氨酸在酸性、弱酸性、碱性条件下反应所得的质谱图分别示于图4b～4d。m/z207.1、225.1分别为[SA-H2O+H]+和[SA+H]+，质谱图中均未观察到[C+H]+和[C+SA+H]+的出现。

在图5a中，m/z142.3、170.4、188.4、210.4、226.3、283.1、329.1、375.1、397.2和584.0分别为[IAA-H2O-CO+H]+、[IAA-H2O+H]+、[IAA+H]+、[IAA+Na]+、[IAA+K]+、[2IAA-2H2O-2CO2+H]+、[2IAA-CO2-H2O+H]+、[2IAA+H]+、[2IAA+Na]+和[3IAA+Na]+。在不同pH值条件下，IAA与半胱氨酸反应所得的质谱图中均未检测到[C+H]+和[C+IAA+H]+。

注：a.50%乙腈；b.pH 3.0；c.pH 6.0；d.pH 9.0图4 SA(a)和SA-C加合物(b,c,d)的MALDI-TOF 质谱图Fig.4 MALDI-TOF mass spectra of the SA (a) and SA-cysteine adducts (b, c, d)

注：a.50%乙腈；b.pH 3.0；c.pH 6.0；d.pH 9.0图5 IAA(a)和IAA-C加合物(b,c,d)的MALDI-TOF 质谱图Fig.5 MALDI-TOF mass spectra of the IAA (a) and IAA-cysteine adducts (b, c, d)

以上结果表明，基质DHB、SA、IAA在酸性、弱酸性、碱性条件下均不与半胱氨酸发生加成反应，且SA和IAA无法使含巯基的氨基酸、肽和蛋白质等生命物质电离从而被检测。

2.1.2HCCA与DTT还原A3加成产物的鉴定 二硫键还原后A3与HCCA反应产物的MALDI-TOF质谱图示于图6。m/z2 381.1为[chain A+H]+，m/z3 399.1为[chain B+H]+。m/z2 570.6、2 759.3、3 588.2分别为[chain A+HCCA+H]+、[chain A+2HCCA+H]+、[chain B+HCCA+H]+，分别产生1个189.1 u、2个189.1 u和1个189.1 u质量数的迁移。结果表明，多肽结构中巯基与HCCA发生加成反应。

图6 碱性条件下，DTT还原猪胰岛素与HCCA反应产物的MALDI-TOF质谱图Fig.6 MALDI-TOF mass spectrum of reaction product of reduced insulin from porcine pancreas and HCCA under alkaline condition

2.2 ESI-MS结果分析

2.2.1半胱氨酸与HCCA反应产物的高分辨质谱鉴定 碱性条件下，半胱氨酸与HCCA反应产物的正离子模式高分辨质谱图示于图7，准分子离子峰m/z122.026 6为[C+H]+。通过分析m/z311.070 6的元素组成(误差3.3×10-6)，可以确认其为加成产物的准分子离子峰[C+HCCA+H]+，列于表1。高分辨质谱结果证实了MALDI-TOF质谱结果，半胱氨酸与HCCA确实发生了加成反应，HCCA的质量数迁移了189.0 u(1分子半胱氨酸)。

图7 碱性条件下，半胱氨酸与HCCA反应产物正离子模式高分辨质谱图Fig.7 Accurate mass spectrum of cysteine-HCCA mixture under alkaline condition in positive ion mode

表1 半胱氨酸与HCCA反应产物元素分析(m/z 311.070 6)Table 1 Elemental composition of cysteine and HCCA reaction product at m/z 311.070 6

2.2.2M与半胱氨酸、A1、A2反应产物的鉴定 本实验考察了HCCA衍生物α-氰基-4-甲氧基肉桂酸与半胱氨酸的反应，示于图8，m/z122.0、325.4分别对应[C+H]+、[C+M+H]+。五肽RCDAA和RCEAA与M的反应产物去质子化质谱峰分别为m/z736.1[A1+M-H]-和750.3[A2+M-H]-。由于A1和A2中存在天冬氨酸和谷氨酸，这2个加合产物离子峰均为负离子模式检测。

注：m/z 325.4 对应的是半胱氨酸与M的加合产物图8 正离子模式下，半胱氨酸与M的加成产物电喷雾质谱图(pH 9.0)Fig.8 ESI mass spectrum of cysteine and M adduct under alkaline condition in positive ion mode

2.3 半胱氨酸与HCCA加成产物的质谱碎裂研究

本研究所有质子化和去质子化的分析物-基质加成产物的碎片离子列于表2。前期研究中，在分析物与基质所得产物的MS/MS质谱图中，主要为分析物与基质加合物的信号峰，表明基质与分析物的反应产物以非共价键结合的形式存在[16-17]。本研究中，在质子化或去质子化的分析物与基质加成产物的MS/MS质谱图中，基质、分析物的信号峰均未出现或以很低丰度的形式出现，碎片峰都是全新的离子峰，说明基质与分析物发生了加成反应，以共价化合物的形式存在。以半胱氨酸与HCCA质子化加成产物(表2中C&HCCA)的MS/MS质谱图为例，对裂解机理进行研究，示于图9。母离子为m/z311.1，产生碎片离子m/z294.0、276.0、226.1。在线路1中，加成产物的羰基氧原子捕获1个质子，形成离子a(m/z311.1)，然后丢失1分子H2O和—C3HNO，形成碎片离子b(m/z226.1)。在线路2中，加成产物的氨基捕获1个质子，形成离子c(m/z311.1)，然后丢失1分子氨，形成离子d(m/z294.0)，离子d发生电荷迁移，形成离子e(m/z294.0)，最后丢失1分子H2O，形成离子f(m/z276.0)。

表2 CID质谱图中质子化和去质子化加成产物碎片离子Table 2 Fragment ions of protonated and deprotonated adducts in CID mass spectra

图9 质子化半胱氨酸与HCCA加成产物可能的碎裂机理Fig.9 Proposed fragmentation mechanisms of the protonated cysteine and HCCA adduct

对碎片离子和碎裂途径的研究不仅能为反应产物的结构确定提供参考，还可以根据基质与分析物加成产物的MS/MS质谱图中基质与分析物信号峰均未出现或丰度很低确定α,β-不饱和基质与含巯基的氨基酸、肽和蛋白是通过共价键结合的。

3 结论

本工作采用MALDI-TOF MS和ESI-MS研究含巯基的生命物质(氨基酸、肽及蛋白质)与MALDI常用基质α-氰基-4-羟基肉桂酸在酸性、弱酸性、碱性条件下的加成反应。结果发现，碱性条件下极易发生含巯基生命物质与HCCA的加成反应，质谱图中会出现189.1nu(n表示巯基的数目)的质量数迁移。HCCA与半胱氨酸的加成产物得到了高分辨质谱的确认。此外，使用串联质谱技术对此加成产物进行碰撞诱导裂解研究，通过MS/MS结果推测出碎裂机理，确认此加成产物为共价键结合。在此基础上开展了HCCA衍生物α-氰基-4甲氧基肉桂酸与含巯基生命物质加成反应的拓展研究。此研究加深了MALDI基质与含巯基生命物质之间加成反应的理解，对含有巯基分析物的质谱测试和分析具有借鉴意义，同时为基质的选择提供了参考。