江西省地方蚕豆种质资源遗传多样性分析及优异资源挖掘

2022-03-16辛佳佳张南峰程华萍戴兴临张洋涂玉琴涂伟凤谷德平关峰汤洁

江苏农业学报 2022年1期

辛佳佳　张南峰　程华萍　戴兴临　张洋　涂玉琴　涂伟凤　谷德平　关峰　汤洁

摘要：利用蚕豆的22个主要农艺性状和8个简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）标记对“第三次全国农作物种质资源普查与收集行动”中收集到的57份江西省蚕豆种质资源进行遗传多样性分析。结果表明：江西省地方蚕豆种质资源具有丰富的遗传多样性，单株分枝数及单株总荚数与蚕豆籽粒的大小呈显著负相关。农艺性状聚类分析将57份种质资源分为两大类，其中第Ⅰ类群单株产量较高，可作为潜在高产优质蚕豆育种材料。8个SSR标记共扩增出65条清晰、可识别的条带，其中多态性条带49条，多态率为75.38%。通过NTSYS聚类分析，在遗传相似性系数为0.743处将57份蚕豆种质资源分为3个类群，这些类群中不同来源的种质相互交错，表明江西省蚕豆资源间的基因交流较充分。综合以上结果，筛选出4份优异的蚕豆资源，分别具有产量高、抗性强、高钙高蛋白质含量等特点，可作为蚕豆新品种的育种材料。研究结果可为蚕豆种质资源的评价利用及蚕豆育种亲本的选择等提供理论基础。

关键词：江西;蚕豆;种质资源;简单重复序列（SSR）;遺传多样性

中图分类号： S643.602.4 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2022）01-0020-10

Abstract： In this study， 22 main agronomic characters and eight simple sequence repeat （SSR） markers were used to study and analyze the genetic diversity of 57 broad been germplasm resources collected in the third national investigation and collection of agricultural germplasm resources. The results showed that the local broad bean germplasm resources in Jiangxi province had rich genetic diversity， and the number of branches per plant and total pods were significantly negatively correlated with the size of broad bean seeds. The 57 broad bean germplasm resources were divided into two categories by cluster analysis， the group I had higher yield per plant and could be used for high-yield breeding. A total of 65 clear and identifiable bands were amplified by eight SSR markers， including 49 polymorphic bands， with a polymorphism rate of 75.38%. According to NTSYS cluster analysis， 57 broad bean germplasm resources could be divided into three groups at the genetic similarity coefficient of 0.743. The germplasms from different sources in these groups were interlaced， indicating that broad bean resources in Jiangxi were fully exchanged. Based on the above results， four excellent broad bean resources with high yield， strong resistance， high calcium and high protein content were screened and could be used as breeding materials for new varieties of broad bean. The research results can provide theoretical basis for the evaluation and utilization of broad bean germplasm resources and the selection of parents for broad bean breeding.

Key words： Jiangxi;broad bean;germplasm resources;simple sequence repeats （SSR）;genetic diversity

蚕豆（Vicia faba L.），别称马齿豆、胡豆、罗汉豆等，属于豆科蝶形花亚科巢菜属，为一年生或越年生草本植物[1-2]，其营养价值高，蛋白质含量高达25%～35%，且富含糖、矿物质、维他命、钙和铁[3]。蚕豆既可作为传统口粮，又是现代绿色食品和营养保健食品。据统计，中国蚕豆种植面积占世界种植总面积的34.5%，产量高达1.96×103kg/hm2，总产量居世界第一（http：//www.fao.org）。中国蚕豆种植于秋播、春播两大生态区，前者以西南地区、长江流域为主，后者以西北、华北北部为主。江西省处于长江中下游，具有良好的农业生态环境，具备适宜种植蚕豆的生态条件。中国长期保存的国内外蚕豆种质资源中有63.6%为国内地方品种和育成品种，36.4%从国外引进[4]。种质资源是品种改良和选育的物质基础，是生命延续和种族繁衍的保证。种质资源的收集、鉴定及评价是许多育种工作者和遗传学家都非常关心的问题[5-6]。由于蚕豆品种的改良起步比较晚，目前农户种植的蚕豆品种主要是一些地方品种，这在很大程度上限制了蚕豆种植面积的扩大和产量的提高。搜集和评价江西省蚕豆地方种质资源，有利于提高江西省蚕豆种质资源的利用效率，同时加快优异种质资源利用的步伐。

本研究依托“第三次全国农作物种质资源普查与收集行动”项目，共收集了57份江西省地方蚕豆种质资源，对其主要农艺性状进行观察及测定，并结合简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）分子标记技术，综合研究其遗传多样性，以期为蚕豆种质资源的评价利用及新品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为“第三次全国农作物种质资源普查与收集行动”项目中收集到的江西省地方蚕豆种质资源，共计57份，种质资源的编号、种质名称及收集地点见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 田间农艺性状调查根据“第三次全国农作物种质资源普查与收集行动”项目安排，江西省蚕豆种质资源调查主要选择在永修县、修水县、分宜县、横峰县、铜鼓县、安福县等27个作物种质资源丰富的农业县进行，田间管理参考当地模式，田间性状的记载参照《蚕豆种质资源描述规范和数据标准》[7]，调查内容包括生长习性、生育天数、花旗瓣颜色、株高、分枝数、单株产量、粒型、粒色、百粒质量等信息，每份材料选取5株进行性状调查，其中数量性状以其平均值作为最终数值[8-9]。

在质量性状赋值方面，花旗瓣颜色赋值如下：1=白，4=浅红，5=紫红;粒形赋值如下：2=窄厚，3=中厚，5=阔厚，6=阔薄;粒色赋值如下：1=白，4=黄，7=浅绿，8=绿;脐色赋值如下：1=褐，3=黑;粒型赋值如下：1=小粒型，2=中粒型，3=大粒型。

1.2.2 基因组DNA提取取约0.5 g新鲜叶片，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基因组DNA[10]，用紫外核酸测定仪测定提取的DNA含量和纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测，将DNA含量统一稀释到50 ng/μl，在-20 ℃低温下长期保存备用。

1.2.3 SSR引物与PCR扩增 SSR引物参照中国农业科学院作物科学研究所张红岩[11]的研究结果，本研究利用表型差异较大的蚕豆材料，对文献中记载的17对高效SSR引物进行进一步筛选，挑选出条带清晰、多态性高、稳定性好的核心引物，淘汰扩增结果中带型不易辨认的引物，共筛选到8对高效SSR核心引物（表2）。PCR扩增总体积为10.0 μl，其中包括5.0 μl 2×Taq Mastermix、0.5 μl上游引物、0.5 μl下游引物、1.0 μl模板、3.0 μl ddH2O。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，最佳温度下退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，采用银染法进行染色[12]。

1.2.4 数据处理及统计分析采用Excel 2003计算蚕豆农艺性状的平均值、标准差、变异系数及多样性指数（H′）等，其中多样性指数采用Shannon-Wiener法[13]计算，公式：H′=-∑Pi×lnPi，式中：Pi为某性状第i级变异类型出现的频率。聚类分析采用SPSS 19.0，聚类方法采用Ward法（离差平方和法）[14]。

SSR引物的多态性及聚类分析。选择条带清晰的PCR条带，人工读带，无条带的记为0，有条带的记为1，采用NTSYS 2.1软件分析57个供试蚕豆种质间的遗传相似性系数，聚類分析使用UPGMA法[15]，用SHAN绘制树状图。

2 结果与分析

2.1 农艺性状多样性分析

2.1.1 主成分分析对57份蚕豆种质资源的17个数量性状进行主成分分析，结果见表3、表4。根据特征值大于1的原则，筛选到5个主成分，累计贡献率达到73.174%。主成分1的特征值为5.040，贡献率为29.650%，该成分中单株总荚数的特征值最大，为0.890，其次是有效枝数、单株产量、单株分枝数、株高，特征值分别为0.882、0.864、0.863、0.696，这些都会影响单株产量，所以第1主成分视为产量因子。主成分2的特征值为3.001，方差贡献率为17.655%，其中粒长、粒宽、荚宽、荚长的特征值较大，分别为0.820、0.783、0.482、0.616，这些都与蚕豆籽粒的大小有关，因此第2主成分为蚕豆粒型因子;单株分枝数、有效枝数、单株总荚数的特征值均为负值，分别为-0.066、-0.090、-0.129，说明单株分枝数与总荚数会限制蚕豆籽粒的大小，因而在选育蚕豆新品种时，应权衡高产与粒型，作出合适的选择。主成分3的特征值为1.636，方差贡献率为9.625%，对该成分影响较大的是生育天数、单株粒数、初花节位、初荚节位。根据性状数值和特征值的综合表现，随着生育天数的增加，植株对营养物质的吸收得到增强，初花节位与初荚节位也表现出增高趋势。主成分4的特征值为1.540，方差贡献率为9.057%，对主成分4影响最大的是粒厚。主成分5的特征值为1.222，方差贡献率为7.188%，对主成分5影响较大的是每花序的花朵数，特征值为-0.474，每个花序的花朵数量越多，蚕豆籽粒的粒长、粒宽、粒厚越小。通过主成分分析不难发现，这些性状中单株分枝数、有效枝数、单株总荚数、单株产量、粒长、粒宽、粒厚为主要特征向量，可作为后续蚕豆新品种选育过程中亲本评价的重要标准。

2.1.2 遗传多样性分析对57份蚕豆材料的22个主要农艺性状进行遗传多样性分析，结果见表5、表6。57份蚕豆材料的生育天数为101.00～146.00 d，平均生育天数为137.04 d;平均株高为97.81 cm，序号为51的株高最高（130.00 cm），序号为57的株高最矮（50.00 cm）;平均单株总荚数为54.37个，平均单株粒数为74.44粒;平均单株产量为61.06 g，序号为10的单株产量最小（33.93 g），序号为55的单株粒数、单株产量均最大（单株粒数为229.00粒，单株产量为219.29 g）。22个农艺性状在不同种质间存在明显差异，遗传多样性指数为0.356～2.046，粒宽的遗传多样性指数最大，为2.046，粒色的遗传多样性指数最小，为0.356。其中最高茎枝节数、单株分枝数、有效枝数、单株总荚数、单株粒数、荚长、荚宽、粒长、粒宽和粒厚的遗传多样性指数偏高，范围为1.867～2.046，说明不同材料之间的产量差异较大，可为筛选高产型优异种质资源提供可靠依据。

2.1.3 基于农艺性状的聚类分析采用Ward系统聚类法建立聚类树状图，由图1可以看出，57份蚕豆种质资源可分成2大类群，其中第Ⅰ类群包含17份种质资源，这个类群的主要特点是单株分枝数较多、单株产量较高（表7）。除此之外，第Ⅰ类群蚕豆的花旗瓣颜色均为红色，粒色均为浅绿色。第Ⅱ类群包含40份种质资源，占整个种质资源的70.2%，这个类群的主要特征是单株分枝数较少，单株产量较低，且花旗瓣颜色与粒色具有较高的多样性。

2.2 基于SSR分子标记的遗传多样性分析

2.2.1 SSR标记的遗传多样性分析用8对核心引物对57份蚕豆种质资源进行扩增、检测，共扩增出65条清晰可识别的条带，其中多态性条带有49条，多态率为75.38%，8对核心引物扩增的片段大多集中在200～750 bp（图2）。各个SSR位点的多态信息含量（PIC）为0.42～0.84，平均PIC为 0.69（表8），表明这8对核心引物具有丰富的多态性，可用于供试材料的遗传多样性分析。

2.2.2 SSR标记的聚类分析用NTSYS 2.1对电泳谱带进行聚类分析，得到聚类树状图（图3）。由图3可以看出，57份蚕豆种质资源的遗传相似性系数为0.480～0.980，其中序号为16的蚕豆种质与序号为56的蚕豆种质之间的遗传相似性系数最小，为0.480，表明这2份蚕豆种质资源间的亲缘关系最远，而序号为44的蚕豆种质与序号为49的蚕豆种质的遗传相似性系数最大，为0.980，表明这2份蚕豆种质资源间的亲缘关系最近。在遗传相似性系数为0.743处，将57份蚕豆种质资源分成3大类群，第Ⅰ类群包括48份蚕豆种质资源，第Ⅱ类群只有14号蚕豆种质资源，说明序号为14的蚕豆种质与类群Ⅰ中的48份种质之间存在较大差异。第Ⅲ类群包括8份蚕豆种质资源，这些种质中除了序号为42的蚕豆种质的花旗瓣颜色是紫红色，其他7份种质的花旗瓣颜色均为浅红色。尽管第Ⅲ类群的种质均来自赣北地区，但总体聚类结果显示，不同来源的种质间相互交错，表明江西省蚕豆种质资源间的基因交流较为充分。

2.3 江西省蚕豆优异种质资源的挖掘

根据以上结果，同时结合品质分析、抗病性分析、产量分析等进行深入鉴定评价，从57份种质资源中筛选出4份优异资源。楼下蚕豆（采集序号为29，图4A）于万年县苏桥乡楼下村采集，该种质的蛋白质含量最高，达29.5%，兼具较高的钙含量（1.820 g/kg），营养丰富，是优质食用型蚕豆资源;江边蚕豆（采集序号为41，图4B）于上高县翰堂镇江边村采集，该种质秆高，茎粗，抗倒伏能力较强，对赤斑病的抗性很好，发病率只有5%，且发病症状轻微，其他种质资源的发病率为10%～40%，可作为潜在的高抗优异蚕豆育种材料;同兴蚕豆（采集序号为5，图4C）于永修县吴城镇同兴村采集，该种质叶片颜色深绿、叶面光滑、花色鲜艳且呈深紫色、株型美观、易种植，可作盆景供观赏;张村蚕豆（采集序号为55，图4D）于婺源县镇头镇张村村采集，该种质开花多、结荚密、粒大饱满、色泽亮、产量高，单株粒数达229粒，单株产量达219.29 g，可作为高产优异的蚕豆育种材料。

3 结论与讨论

现代育种离不开丰富的种质资源[16-17]而地方品种经过长时间特定环境及农户的定向选择[18]，留下了很多优异性状。广泛收集蚕豆种质资源，对其农艺性状进行观察与分析，并进行精准鉴定与遗传多样性分析，从而了解蚕豆种质资源的多样性及其性状之间的关系，既可为后续加强蚕豆种质资源的有效利用提供材料基础，又可为蚕豆新品种的选育提供参考[19]。

本研究利用22个主要农艺性状对57份江西省地方蚕豆种质资源进行遗传多样性分析，结果表明，57份江西省地方种质资源的农艺性状变异范围较大，变异系数为4.55%～53.17%，变异系数最小的是生育天数，变异系数最大的是单株粒数。变异系数能够反映性状间的变异程度，变异系数越大，说明性状间存在越丰富的变异类型，越具有改良潜力[20]。从试验结果看，蚕豆单株粒数的变异系数最大，可通过相关改进技术（品种选育、栽培、温度、光照度）等较大程度地提高总粒数，而生育天数的变异系数最小，可以通过育种手段加以改变，但获得理想目标性状的难度较大[21]。因此，在高产蚕豆品种选育过程中，首先应该注重单株粒数的提高，之后再考虑其他性状。

农艺性状聚类分析将57份蚕豆种质资源分成两大类群：第Ⅰ类群包含17份种质资源，第Ⅱ类群包含40份种质资源，类群Ⅰ的单株产量较类群Ⅱ显著增加。SSR标记聚类的结果表明，供试蚕豆种质资源的遗传关系与地理来源间的相关性不大，这与多数前人的研究结果[22]一致。本研究分别通过主要农艺性状和SSR分子标记2种方法对江西省地方57份蚕豆种质资源进行遗传多样性分析，两者的聚类结果并不完全一致，这种情况在其他作物如辣椒[23]、梅花[24]、红三叶[25]中也曾有报道，原因可能有2个：一方面，蚕豆的农艺性状容易受外界环境的影响，导致鉴定结果可能会出现一定的偏差;另一方面，挑选的8对核心引物所在的SSR位点与所调查的农艺性状可能并不存在一定关联[26]。

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